Cell：MLL重排依賴的白血病的新型靶向治療方案

BioArt按：2017年1月5日，Cell在線發表了來自美國西北大學、斯托瓦斯醫學研究所Ali Shilatifard實驗室發表了題為「Therapeutic Targeting of MLL Degradation Pathways in MLL-Rearranged Leukemia」的重要文章，該項研究推出了一種針對MLL重排依賴的白血病的新型治療方案，具有極高的臨床應用價值。Ali Shilatifard實驗室最早在酵母中分離純化了Set1/COMPASS複合物（PNAS，2001），此後該實驗室主要圍繞該複合體做了大量原創性的研究工作，武漢大學生科院吳旻教授曾在其實驗室做過博後。Ali Shilatifard還是Science雜誌的編委，Science Advances雜誌的副主編和eLife雜誌的編委。

撰文丨馬潤澤（中科院生物物理所）

研究背景：

混合譜系白血病（MLL），包括急性骨髓細胞白血病和急性淋巴細胞白血病，是一種惡性程度很高且預後較差的疾病，因11q23處染色體易位形成MLL融合蛋白而得名。MLL蛋白與WDR5、RBBP5、DPY30、ASH2等相互作用形成COMPASS複合體（下圖），該複合體通過甲基化H3K4來調控同源異型基因的表達。MLL蛋白全長有4000個氨基酸，但因為Taspase I的蛋白水解作用，MLL在細胞內主要以N末端320KD片段（N320）和C末端180KD片段（C180）兩種形式存在。

MLL基因會與70多種不同的基因進行易位，MLL蛋白的N末端與其他蛋白的C末端融合形成多種多樣具有致癌性的MLL嵌合體。在白血病細胞中，其中一部分MLL嵌合體是MLL與super elongation complex（SEC）或者DOT1L複合體（DotCom）形成的。MLL的染色質結合結構域與SEC或者DotCom亞基形成的嵌合體能夠導致SEC或者DotCom招募異常，進而使得MLL調控的基因表達失調，從而使得細胞增殖和分化缺陷。

破壞造血幹細胞內野生型的MLL能夠損害MLL-AF9白血病的起始。但是在ML2白血病細胞中，整個MLL野生型拷貝是丟失的，這暗示著野生型的MLL對MLL白血病的維持並不是必需的。又因為致癌性的MLL嵌合體和野生型的MLL具有相同的N末端，那麼野生型MLL和MLL嵌合體之間的相互作用至今仍不清楚。

文章解讀：

Ali實驗室通過western blot實驗發現在多種白血病細胞中野生型MLL比MLL嵌合體少很多（下圖A）。蛋白質少，那是因為翻譯該蛋白的RNA少呢還是蛋白質降解呢？他們通過基於SNP的RNAseq發現RNA量差不多，那就暗示著是野生型MLL不如MLL嵌合體穩定。那麼是什麼導致野生型MLL較容易被降解呢？野生型MLL與MLL嵌合體具有相同的N末端，那麼很自然地去想，應該是存在某些蛋白特異性地與MLL的非N末端相互作用，導致野生型MLL降解。Ali實驗室表達並純化帶有Halo標籤的MLL中間片段和帶有Halo標籤的MLL C末端。通過多維蛋白質鑒定技術（MudPIT）發現MLL中間片段能夠與UBE2O這個泛素連接酶相互作用，該相互作用能夠引起野生型MLL的降解。［筆者註：MudPIT為尋找蛋白質上修飾所對應的修飾酶提供了一種參考方案。］

怎樣一條分子通路介導野生型MLL的降解呢？Ali實驗室首先在HEK293細胞內過表達帶有Halo標籤的MLL，從中挑選出MLL表達量較低的細胞進行了全基因組的shRNA篩選。［筆者註：因為是進行shRNA篩選，並且真實的白血病細胞中野生型MLL量很低，因此他們選擇了那些表達Halo-MLL量較低的細胞進行後續實驗，我個人覺得這是一個非常巧妙的設計。］通過該shRNA篩選，他們找到了303個基因，通過後續的生物信息學分析，發現IL-1和細胞因子受體明顯富集。那麼IL-1信號通路真的能夠調控野生型MLL的穩定性么？他們實驗發現IL-1β能夠迅速地增強MLL-Inter和UBE2O的相互作用並誘導MLL的降解（下圖）。並且體外實驗發現，IL-1信號通路中的IRAK4能夠磷酸化UBE2O。

在細胞內IRAK4的激酶活性對野生型MLL的降解是必需的么？他們發現IRAK1/4的小分子抑制劑能夠增強野生型MLL的穩定性，MudPIT實驗證明野生型MLL穩定性的增強是通過降低MLL與UBE2O的相互作用實現的。

野生型MLL穩定性的增強會有怎樣的生物學作用呢？ChIPseq結果發現IRAK1/4小分子抑制劑能夠增強MLL在其靶基因上的結合。對白血病細胞使用IRAK1/4小分子抑制劑能夠降低MLL依賴的白血病細胞的增殖。那麼，這兩者之間存在怎樣的機制呢？Ali實驗室發現使用IRAK抑制劑處理後MLL-AFF1嵌合體和SEC亞基AFF4在1311個基因啟動子區域的結合降低並且這些基因的表達量降低。［筆者註：因為Ali實驗室沒有特異性識別MLL嵌合體的抗體，他們採用比較MLL融合組分AFF1和SEC亞基AFF4的共染色體定位方案進行ChIP結果分析，這一策略可以在研究其他融合蛋白時可以被借鑒。在此處，我有一個疑問，為什麼Ali實驗室沒有看一下IRAK抑制劑處理後，在MLL嵌合體結合下降的染色質位點上，野生型MLL的結合有沒有相應的增加。這一問題只需要使用針對MLL-Inter或者MLL-CT的抗體進行ChIPseq即可回答。］

Ali實驗室在體外製備MLL細胞後將白血病細胞移植到小鼠體內，隨後將IRAK的抑制劑注射到患病小鼠體內，發現抑制IRAK能夠明顯增長小鼠的壽命，這一發現為治療MLL依賴的白血病提供了一種全新的用藥方案。

工作模型：

MLL融合蛋白因為缺少PHD、Bromodomain等染色質結合結構域，其需要一個比較開放的染色質狀態才能結合染色質。在MLL依賴的白血病細胞中，野生型MLL會被IL1/IRAK4信號通路及UBE2O所降解，MLL與SEC的嵌合體能夠與開放的染色質區域結合，通過磷酸化RNA Pol II CTD的ser2啟動轉錄延伸。當使用IRAK的抑制劑後，野生型MLL不能被降解，野生型MLL與MLL嵌合體競爭性結合染色質，使得MLL嵌合體不能異常啟動致癌基因的轉錄。

（致謝：感謝中科院生物物理所馬潤澤同學分享的論文解讀和閱讀心得！）

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