細菌，居然也有「高智商」？

細菌常常被認為是一類「低等」的單細胞生物，生存方式簡單。然而，現代微生物學研究改變了這一錯誤看法，發現細菌具有許多和高等生物類似的特性。例如，在信號認知這個事關生命生存與死亡的關鍵問題上，細菌不僅能感知環境刺激，而且不同細菌個體之間能利用化合物作為分子「語言」進行細胞間通訊（即群體感應，quorum-sensing），感知同種生物的存在及種群大小，從而在寄主感染、自由生存和逆境適應過程中相互交流，協作行動，表現出明顯的群體性和社會性。

已知細菌的分子「語言」包括高絲氨酸內酯、小肽、喹喏酮等，其中，一類被稱為「擴散調控因子（DSF）」的化合物是黃單胞菌、假單胞菌、嗜麥芽窄食單胞菌和博克氏菌等多種動、植病原細菌進行細胞間通訊的信號物質。

在過去的近30年時間裡，科學家一步步解析著細菌感知 DSF 信號的過程和原理：1991年，廣西大學教授唐紀良在英國開展研究期間，首次發現植物病原細菌（野油菜黃單胞菌）與動物病原細菌一樣，其雙組分信號轉導系統（RpfC-RpfG）也是調控致病力的主要控制機制；1997年左右，英國 John Innes 研究中心教授 MJ. Daniels 及其同事研究表明：RpfC 應該是識別胞外 DSF 信號的受體，但 DSF 究竟是什麼性質的化合物仍然未知；直到2004年，新加坡分子與細胞生物學研究所（IMCB）教授張煉輝研究組成功地從細菌分泌物中鑒定出了 DSF 信號分子，結構解析證明DSF是一種12碳的脂肪酸；此後，研究者鑒定出了許多 DSF 家族的脂肪酸，發現它們不但是細菌個體間通訊的信號化合物，而且也是細菌與真菌、細菌與植物之間進行跨界信號交流的信號物質。雖然後續研究發現了一些能夠結合 DSF 分子的蛋白質（如 RpfR 和 RpfS），但由於它們都是細胞質蛋白，不太像是位於細胞表面感應細胞外 DSF 的受體。而對於早就被研究者推測感應胞外 DSF 信號的 RpfC 來說，由於這個受體結構複雜，是一個含有5個跨膜區的組氨酸激酶，在開展酶學分析和膜蛋白－脂肪酸相互作用研究時技術難度較大，因此一直缺乏直接證據來證明 RpfC 的確就是細菌感知 DSF 的受體。

中國科學院微生物研究所錢韋研究組從事植物病原細菌感知信號的研究，致力於分析細菌雙組分信號轉導系統（即細菌的「智商」）如何識別寄主植物與環境信號。最近，他們成功地將全長 RpfC 組氨酸激酶受體組裝到脂質雙分子層或納米盤（nanodisc）中，獲得了具有酶學活性的蛋白脂質體，為從生物化學水平研究 RpfC 提供了分析平台。基於該平台，他們綜合利用微量熱泳動（MST）、熱遷移（TSA）和圓二色譜等分析技術，證明 DSF 分子直接結合在 RpfC 信號感應區一段長22個氨基酸的區域上，激活 RpfC 蛋白的激酶活性。特別有趣的是，發現在細菌種群密度低時，RpfC 的近膜區（juxtamembrane）抑制自身的激酶活性，但在細菌種群密度較高時，DSF 刺激解除了該抑制，從而激活群體感應信號通路，調控細菌致病因子的表達和生物被膜（biofilm）的形成。因此，該研究從酶學和生物化學角度提出了有力的證據，不但證明 RpfC 確實是 DSF 信號分子的膜受體，解決了細菌細胞間通訊研究中的一個難題，而且建立了膜受體－脂肪酸相互作用生化分析平台，為深入研究 DSF 家族信號分子在細胞間通訊中的調控功能，發展能夠阻斷細菌群體感應過程的新型抗菌化合物打開了突破口。

這項成果是錢韋研究組繼近期發現黃單胞菌的「智商」（即雙組分信號轉導系統）感知高鹽脅迫（Wang et al, 2014,Environ Microbiol.16:2126-2144）、感知寄主植物體內的鐵匱乏環境（Wang et al, 2016.PLoS Pathogens.12: e1006133）之後，再次在該領域做出的重要進展。研究結果已經發表於期刊PLoS Pathogens。微生物所博士研究生蔡珍、袁智惠是論文的並列第一作者。研究獲得了中科院戰略性先導科技專項 B 類和國家自然科學基金面上項目的資助。

論文基本信息

【題目】Fatty acid DSF binds and allosterically activates histidine kinase RpfC of phytopathogenic bacterium Xanthomonas campestris pv. campestris to regulate quorum-sensing and virulence

【作者】 Zhen Cai , Zhi-Hui Yuan , Huan Zhang, Yue Pan, Yao Wu, Xiu-Qi Tian, Fang-Fang Wang, Li Wang, Wei Qian

【刊期】PLoS Pathogens

【日期】 Published 15 March 2017

【DOI】10.1371/journal.ppat.1006304

【摘要】As well as their importance to nutrition, fatty acids (FA) represent a unique group of quorum sensing chemicals that modulate the behavior of bacterial population in virulence. However, the way in which full-length, membrane-bound receptors biochemically detect FA remains unclear. Here, we provide genetic, enzymological and biophysical evidences to demonstrate that in the phytopathogenic bacteriumXanthomonas campestrispv.campestris, a medium-chain FA diffusible signal factor (DSF) binds directly to the N-terminal, 22 amino acid-length sensor region of a receptor histidine kinase (HK), RpfC. The binding event remarkably activates RpfC autokinase activity by causing an allosteric change associated with the dimerization and histidine phosphotransfer (DHp) and catalytic ATP-binding (CA) domains. Six residues were found essential for sensing DSF, especially those located in the region adjoining to the inner membrane of cells. Disrupting direct DSF-RpfC interaction caused deficiency in bacterial virulence and biofilm development. In addition, two amino acids within the juxtamembrane domain of RpfC, Leu172and Ala178, are involved in the autoinhibition of the RpfC kinase activity. Replacements of them caused constitutive activation of RpfC-mediated signaling regardless of DSF stimulation. Therefore, our results revealed a biochemical mechanism whereby FA activates bacterial HK in an allosteric manner, which will assist in future studies on the specificity of FA-HK recognition during bacterial virulence regulation and cell-cell communication.

【鏈接】http://journals.plos.org/plospathogens/article?id=10.1371/journal.ppat.1006304

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