青島能源所降血脂藥物辛伐他汀前體物 Monacolin J 生物合成研究獲進展

圖 1. 辛伐他汀生產工藝及本項目研究方案示意圖

圖 2. 產 monacolin J 土麴黴細胞工廠構建

辛伐他汀（Zocor）是土麴黴天然產物洛伐他汀的半合成衍生物，是一種重要的降血脂葯，2015 年全球銷售額達到 30 億美元。辛伐他汀的工業生產工藝可分為三個過程：土麴黴發酵生產洛伐他汀，鹼水解洛伐他汀製備 monacolin J，化學方法將 monacolin J 轉化成辛伐他汀（圖 1）。針對 monacolin J 轉化成辛伐他汀，美國研究人員前期開發了基於醯基轉移酶 LovD 的生物催化轉化方法，並獲得 2012 年美國總統綠色化學獎。但 monacolin J 的製備仍然是使用傳統的鹼水解洛伐他汀工藝，工序相對複雜、環境污染較大。因此，開發一種綠色高效的 monacolin J 生產方法非常重要。包括默克公司在內的研究團隊曾試圖開發可替代的生物轉化方法，但是由於效率較低，都未能應用到實際生產中。近年來，中國科學院青島生物能源與過程研究所微生物代謝工程團隊基於在絲狀真菌遺傳改造方面的研究基礎，與全球最大的洛伐他汀 / 辛伐他汀原料葯生產企業浙江海正葯業集團進行了深入合作，旨在對海正葯業的洛伐他汀工業生產土麴黴菌株進行代謝工程改造，使之能直接發酵生產 monacolin J。

為了遺傳改造工作的順利進行，該團隊開發了一個高效的土麴黴遺傳操作平台，克隆表徵了一系列高效土麴黴啟動子，為遺傳改造提供啟動子元件支持；通過失活非同源重組末端連接途徑使基因打靶效率從 5% 提高到 90% 以上，解決了基因打靶低下的問題；又結合尿嘧啶營養缺陷雙向篩選體系和改良的 Cre/loxP 位點特異性重組系統實現了篩選標籤的循環利用，突破了篩選標籤不足的限制。該平台為後續的基因工程改造提供了技術平台支持（Huang X., et al., 2014，Huang X., et al., 2016）。

近期，研究團隊通過體外實驗鑒定了一個能高效水解洛伐他汀生成 monacolin J 的洛伐他汀水解酶 PcEST，其活性遠高於專利報道的洛伐他汀水解酶，是後者的 232 倍，而氨基酸序列一致性僅為 16.8%，這說明 PcEST 是不受現有知識產許可權制的高效洛伐他汀水解酶，為研究成果的實際應用提供了知識產權保障。

基於洛伐他汀水解酶 PcEST，該團隊對海正葯業的洛伐他汀工業生產土麴黴菌株進行了遺傳改造。利用強啟動子 PgpdAT 異源表達洛伐他汀水解酶，成功地在不影響他汀化合物總產量的情況下將體內合成的洛伐他汀水解成了 monacolin J，水解率達到 95%，從而獲得了能直接發酵生產 monacolin J 的土麴黴細胞工廠。該工作實現了直接利用現有的洛伐他汀發酵工藝和設備，一步發酵直接生產 monacolin J ，不再需要洛伐他汀水解過程，簡化了辛伐他汀的生產工藝，有望降低企業的生產成本和污染排放。相關成果近日發表於 Metabolic Engineering 上（Huang X., et al, 2017），並與海正葯業聯合申請了發明專利（201611079430.2）。

上述研究獲得國家自然科學基金和海正葯業集團的支持。

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