技術專題：如何有效遞送基因編輯體系

對遺傳性疾病進行基因組編輯治療，需要克服的最大挑戰是安全和基因組編輯生物大分子的有效傳遞。我們這個專題介紹在非病毒和病毒方法中，基因編輯生物大分子的遞送原理和選擇依據。

隨著CRISPR技術的新發展，改造基因組變得越來越容易。CRISPR基因組編輯系統，以及轉錄激活因子樣效應核酸酶（TALENs）和鋅指核酸酶（ZFN），正成為生物醫學研究、藥物發現和開發甚至基因治療的寶貴工具。

然而，對於這些系統中的每一個，有效地進入目標細胞並執行功能需要功能、高效和安全的遞送技術。對遺傳性疾病進行基因組編輯治療，需要克服許多障礙才能實現。要克服的最大挑戰是安全和基因組編輯生物大分子的有效傳遞。

我們這個專題介紹在非病毒和病毒方法中，基因編輯生物大分子的遞送原理和選擇依據。

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基因編輯平台

鋅指核酸酶（ZFN），轉錄激活因子樣效應因子（TALE）核酸酶（TALEN）和CRISPR–CAS系統可誘導DNA的雙鏈斷裂（DSBs）。兩種機制之一修復雙鏈斷裂實現基因組編輯：非同源末端連接（NHEJ）或同源定向修復（HDR）。NHEJ通過插入或缺失破壞靶基因，而HDR將供體DNA模板插入目標基因組中，完成對基因組序列插入、缺失或改變。

圖1 基因組編輯機制

想要將生物大分子遞送到細胞內進行基因組編輯，含有這些生物大分子顆粒首先要避免細胞外的障礙。這些障礙包括被巨噬細胞吞噬細胞吞噬，或者是被酶降解或水解，以及誘導免疫反應和產生細胞因子的能力。

如果這些生物大分子和納米顆粒可以避免被身體排斥，能進入合適的器官或血液中，它們還必須進入靶細胞。一旦進入細胞，生物大分子和納米顆粒必須逃脫內涵體，定位於細胞質的mRNA或細胞核成功地編輯目標基因。

圖2 遞送基因編輯體系的障礙

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常用基因編輯體系的遞送方法

病毒還是非病毒

對基因編輯體系的遞送方法一般可以歸類為病毒（表1）或非病毒（圖3,4）。病毒的方法利是用病毒載體（例如，AAVs，慢病毒與腺病毒）以RNA或DNA形式來包裝體系，以促進有效的遞送。非病毒遞送的方法包括物理方法（例如電穿孔和基於微流控的技術），基於納米材料的方法（例如，陽離子脂質體和細胞穿透肽（CPPS））以及自組裝納米粒子。

表1 用於基因編輯的三種主要類型病毒的特點

物理方法：可以不使用納米粒子，對將進行基因組編輯的生物大分子遞送到細胞內。比如顯通過體外微注射，體外直接注入胚胎或受精卵；或在體內進行流體動力學注射。另外，電穿孔或機械變形可以在細胞膜中產生短暫的孔隙，從而促進基因組編輯的生物大分子進入細胞。

圖3 用於基因組編輯生物大分子遞送的物理方法

遞送基因組編輯生物大分子的兩類主要的非病毒納米粒子是由陽離子材料製成的：脂類（圖4中A部分）和聚合物（圖4中B部分）。這樣的納米粒子和帶負電荷的核酸或核糖核蛋白複合物絡合和封裝。圖中可電離的脂質C12-200和8-O14b111已製成脂質納米粒包裝Cas9編碼mRNA或核糖核蛋白複合物。此外，基因組編輯生物大分子還可以被封裝成殼聚糖修飾的PLGA納米粒和PEI自組裝DNA納米顆粒，被稱為「DNA nanoclews」。

圖4 對基因組編輯生物大分子的非病毒納米顆粒輸送

體內還是體外

對於某些組織，基因組編輯系統可以在體外遞送：通過從病人提取原代細胞，基因編輯這些細胞然後移植，讓改性的細胞回到病人體內。一個潛在的靶組織是造血系統。體外遞送可以使用無法系統實施的物理方法。比如質粒的體外電穿孔能提高相對高的轉染效率。逆轉錄病毒和慢病毒載體也可以在體外遞送使用，能在造血幹細胞或初級淋巴細胞穩定表達基因。

相對於體外治療的遞送，體內基因組編輯面臨額外的障礙，對於病毒和非病毒體系是不同的。

病毒系統向各種組織（包括肝臟、眼睛、骨骼、肌肉和心臟）遞送遺傳遺傳物質的能力和有效性已經進行了研究。病毒系統的廣泛適應性對於遞送可編程的核酸酶很有吸引力。這些病毒系統一次注射就可以誘導人類長期的轉基因表達。因此，轉基因核酸酶長期表達對基因組穩定性和組織中抗原性的影響，都需要進一步調查。

脂質基和聚合物基納米顆粒共軛技術可以促進RNA在體內遞送，並能在臨床的各個階段進行。這些非病毒平台也可用於提供可編程的核酸酶，使其瞬間在目標組織表達。

鑒於體內和體外給葯途徑所面臨的不同挑戰，方法及最佳操作程序將有所不同。然而，大多數組織治療用途的基因組編輯不能在體外執行。有效的體內遞送將是必需的。

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基因傳遞載體的選擇依據

質粒編碼的基因組編輯相關蛋白必須成功轉染到細胞的核裡面，轉錄它們的基因，並最終被翻譯。細胞和核膜都是需要進入的物理壁壘；大的、如DNA、RNA和蛋白質這些親水性分子不能有效地通過這些疏水性膜。此外，體內環境提出了更多複雜的核酸遞送要求：裸露的核酸會受血液中的內源性核酸酶降解，可能作為一個外來核酸激活免疫系統，所以最好只轉染靶細胞。由於這些原因，通常用遞送載體來保護核酸或蛋白質貨物，封裝後針對特定的細胞和跨膜屏障有效載荷穿梭。

病毒載體

逆轉錄病毒、腺病毒和腺相關病毒（AAV），這三大類病毒，已經在提供遺傳物質的治療方面進行了廣泛的應用。

逆轉錄病毒載體的特點是通過逆轉錄複製，例如，慢病毒載體，逆轉錄病毒載體的一個子類，可以將病毒DNA整合到不進行細胞分裂的細胞中，如神經元或肌肉細胞。

腺病毒載體只傳遞病毒雙鏈DNA，而不是將其併入宿主細胞基因組中，使其適用於需要瞬時蛋白表達的應用。AAV載體是小的、簡單的，游離的病毒能夠轉導分裂細胞和非分裂細胞。

在臨床試驗中，一些病毒載體已經證明有效的基因傳遞，但病毒基因治療的歷史也存在著嚴重的安全問題。AAV是非致病性，有望但在人類成為安全的基因載體，其長期影響表達的耐久性需要進一步調查。

非病毒載體

基於非病毒材料的遞送載體比病毒載體具有更小的毒性和免疫原性，但也存在著一系列的遞送方面問題的挑戰。帶負電荷的DNA和其它核酸可以被陽離子材料靜電絡合形成納米顆粒，隨後可被通過各種機制（包括受體介導的內吞作用和吞噬作用）的細胞吞噬。

迄今為止用於核酸傳遞的陽離子材料類中，最成功的是天然發生的和合成的聚合物（例如聚乙烯亞胺、環糊精和聚β氨基酯）和脂類（例如脂質體，設計好的脂質和脂質類似物）。

理想情況下，任何非病毒遞送材料用於基因組編輯都應具有良好的耐受性（生物相容性，非免疫原性），並且能夠向細胞核遞送有效載荷。

物理遞送（無載體遞送）

在某些情況下，基因組編輯不需要遞送載體。

在體外治療中，機械變形或電穿孔可以在細胞膜上產生短暫的孔，使核酸和蛋白質進入細胞。

用於體內治療的話，高濃度的、裸核酸的尾靜脈水動力注射能有效地轉染小鼠肝細胞，但有可能導致致命的急性副作用，在人類中很少採取直接注射。

核酸也可以直接注入胚胎或受精卵，但人類胚胎的基因組編輯仍然備受爭議。

在這些局限性，臨床上可用於基因組編輯體內治療可能還是需要一個載體。

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臨床研究進展

一些正在進行的臨床試驗正在評估ZFN靶向單基因和傳染性疾病的效果，比如修飾CCR5（HIV-1入侵機體細胞的主要輔助受體之一）來抵抗艾滋病。具體內容見下表。

美國CRISPR 治療的領跑者Intellia Therapeutics、Editas Medicin和CRISPR Therapeutics正在將CRISPR–Cas9技術用於人類的治療。Intellia Therapeutics正使用脂質的納米顆粒對比如TTR澱粉樣變、α1-抗胰蛋白酶缺乏乙型肝炎病毒與先天性代謝缺陷的肝病進行體內治療的探索。Intellia Therapeutics正用電穿孔介導也開發體外造血幹細胞的CAR T治療計劃。同時Editas Medicine也在積極實施通過AAV在眼睛局部遞送的基因編輯療法的開發。CRISPR Therapeutics也正在評估CRISPR–Cas9的體內和體外治療效果，其中包含體外靶向血紅蛋白病、免疫缺陷以及靶向眼、肝、肺和其它器官的體內治療。

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參考資料：1）Delivery technologies for genome editing

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