雷帕黴素靶蛋白和p70S6激酶及Lgr5蛋白在胃癌組織中的表達及相關性

付漢東1，袁岸龍2，張愛華3，胡校雲1，劉漢中4，黃 唯1，魏 威1，陽仕雄1

作者單位：1.武漢科技大學附屬孝感醫院孝感市中心醫院中心實驗室，湖北孝感4321 00；2．武漢科技大學附屬孝感醫院孝感市中心醫院消化內科，湖北孝感432100；3．武漢科技大學附屬孝感醫院孝感市中心醫院普外科，湖北孝感432100；4．武漢科技大學附屬孝感醫院孝感市中心醫院病理科，湖北孝感432100）

摘要：目的 探討雷帕黴素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)、p70S6激酶(p70S6 kinase，p70S6K)及Lgr5蛋白在胃癌組織中的表達及相關性。方法 採用免疫組織化學法檢測132例胃癌患者手術切除的胃癌組織、癌旁組織標本和30例慢性非萎縮性胃炎患者胃鏡下活檢正常胃黏膜組織標本中mTOR、p70S6K和Lgr5蛋白表達，分析胃癌患者mTOR、p70S6K及Lgr5蛋白陽性表達率與臨床病理特徵的關係，對胃癌組織中Lgr5蛋白表達與mTOR、p70S6K蛋白表達的相關性進行分析。結果 胃癌組織mT()R、p70S6K和Lgr5蛋白陽性表達率分別為65. 15%、61. 36%、70.45%，癌旁組織分別為24.24%、22. 73%、31. 09%，均高於正常胃黏膜組織(10. 00%、13. 33%、6.67%)，且胃癌組織mTOR、p70S6K和Lgr5蛋白陽性表達率高於癌旁組織，差異均有統計學意義(P<0.05)；不同性別，年齡≥50歲與<50歲胃癌患者mTOR、p70S6K和Lgr5蛋白陽性表達率比較差異均無統計學意義(P>0.05)，腫瘤直徑≥5 cm胃癌患者mT()R、p70S6K和Lgr5蛋白陽性表達率(72. 73%、74. 030/<、80. 52%)高於腫瘤直徑<5 cm者(54. 55%、/13.64%、56.360/<)，TNM分期I+Ⅱ期者(50. 98%、45. 10%、54. 92%)低於Ⅲ+Ⅳ期者(71. 07%、72. 84%、80. 52%)，組織學分級G1+G2期者(53. 70%，50.00%，55. 56%)低於G。+G。期者(73. 08%、69. 23%，80. 77%)，淋巴結轉移N0者(42. 22%、44.47%、46. 67%)低於N,+N2+Ns者(77. 01%、70. 11%、82. 76%)，侵犯程度T1+T2期者(42. 11%、42. 11%、44.74%)低於Ts +T1期者(74.47/%、69. 15%、80. 85%)，差異均有統計學意義(P<0.01)；胃癌組織中Lgr5蛋白表達與mTOR、p70S6K蛋白表達呈正相關(r=0.579，P=0.004 6；r—0.502，P=0．007 1)。結論 mTOR、p70S6K和Lgr5蛋白表達與胃癌腫瘤浸潤程度、淋巴結轉移、TNM分期、組織學分級密切相關，可作為評估胃癌患者預後的指標。

關鍵詞：胃癌；雷帕黴素靶蛋白；p70S6激酶；Igr5蛋白

目前，我國胃癌發病率居惡性腫瘤第2位，病死率居癌症相關死亡第3位。多數胃癌患者確診時處於進展期或晚期，術後複發率高。雷帕黴素靶蛋白(mammalian target of rapamycln，mTOR)是細胞生長和增殖的關鍵調節分子，激活後的mTOR蛋白可使p70S6激酶(p70S6 kinase，p70S6K)發生磷酸化，促進肌動蛋白的細絲重構、細胞遷移。Lgr5是富含亮氨酸重複序列G蛋白偶聯受體超家族成員，在細胞的增殖、分化，腫瘤的發生、發展中起重要作用。文獻報道，Lgr5可能是一種腫瘤幹細胞特異性標誌物，可作為腫瘤複發、轉移和預後評估的重要指標。本研究探討mTOR、p70S6K及Lgr5蛋白在胃癌組織中的表達及相關性，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2013年1月 2015年12月孝感市中心醫院診治胃癌患者132例，男73例，女59例；年齡21.5～73.O歲，其中≥50歲104例，<50歲28例；行胃癌根治術66例，胃大部切除術32例，全胃切除術34例，術前均未接受抗腫瘤治療；腫瘤直徑≥5 cm 77例，<5 cm 55例；術後組織病理證實腺癌127例，鱗腺癌5例；組織學分級G1期11例，G2期40例，G3期68例，G4期13例；TNM分期工期5例，Ⅱ期46例，Ⅲ期67例，Ⅳ期14例；有淋巴結轉移87例，無淋巴結轉移45例。同期慢性非萎縮性胃炎患者30例為對照組，男24例，女1 6例；年齡24～52歲；14C呼氣試驗（一）。2組年齡、性別比例差異無統計學意義(P>0. 05)。本研究經孝感市中心醫院倫理委員會審批通過，研究對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1 標本採集 胃癌患者取手術切除胃癌組織、癌旁組織（距腫瘤組織邊緣5cm以上）標本。對照組於胃鏡檢查時採集部分正常黏膜組織，30 min內-80℃保存。

1.2.2 儀器與試劑 兔抗人mTOR、p70S6K、Lgr5多克隆抗體（英國abcam公司）；二抗：羊抗兔箱（青島海爾公司）。

1.2.3 胃黏膜組織中mTOR、p70S6K及Lgr5蛋白表達檢測 採用免疫組織化學Envision法進行檢測，嚴格按試劑盒說明書和儀器操作規程進行操作。10張4～5 μm厚-20℃冰凍切片，室溫放置30 min後，放人體積分數95%乙醇中固定20～30 s，PBS洗片3次，5 min／次；用質量分數3%過氧化氫20～25℃孵育10 min，PBS洗片2次，5 min/次；體積分數10%小牛血清（PBS稀釋）封閉，20～25℃孵育30 min；滴加稀釋一抗T作液(mTOR、p70S6K、Lgr5 PBS稀釋1：100)100～150_uL]片，4℃過夜，PBS洗片3次，5min/次；加酶標記二抗T作液100～150_uL/片，37℃孵育60 min，PBS洗片3次，5 min/次；滴加DAB試劑，室溫反應5 min，蒸餾水沖洗5 min，蘇木精染色1--2 min，蒸餾水沖洗2 min，體積分數75%、85%、95%、100%乙醇逐級脫水，各5 min，中性樹膠封片，鏡檢，用PBS代替一抗作為對照。

1.2.4 結果判定mTOR陽性為細胞質著色，陽性細胞核中有呈淡黃色、深黃色或棕黃色顆粒。p70S6K陽性為細胞質或細胞核中染色呈深黃色或棕黃色顆粒。Lgr5陽性為細胞核中染色呈深黃色或棕黃色顆粒。採用著色強度和陽性細胞百分比雙計分法來判定陽性程度：每張染色切片均隨機選取10個視野，計數所有細胞和陽性細胞數，計算陽性細胞百分比，陽性細胞百分比為O計O分，<25%計1分，25%～50%計3分，>50%～75%計3分，>75%計4分。染色強度計分：無色為O分，淡黃色為1分，黃色為2分，深黃色或棕褐色為3分。著色強度與陽性細胞百分比計分之和<2分為（一），2～4分為(+)，>4～6分為(H)，>6分為（卅）。

1.3 統計學處理

應用SPSS 17.O軟體進行統計分析，計數資料比較採用γ2檢驗，相關性分析採用Pearson法，P

2 結 果

2.1 胃黏膜組織中mTOR、p70S6K、Lgr5蛋白表達情況mTOR蛋白在正常胃黏膜組織著色較淺，細胞質呈淡藍色；在胃癌黏膜組織和癌旁黏膜組織中呈黃色或棕褐色（圖1a-c）。p70S6K蛋白在正常胃黏膜組織著色較淺，細胞質呈淡藍色；在胃癌黏膜組織和癌旁IgG／HRP、DAB試劑盒（北京金橋生物公司）；LelcaCM1950冰凍切片機（德國Lelca公司）；BT-128生物組織快速脫水儀（湖北伯納公司）；BX43-72P02顯微鏡（日本Olympus公司）；DW86L288型-86℃超低溫冰黏膜組織中呈黃色或棕褐色散在的顆粒（圖1 d-f）。Lgr5蛋白在正常胃黏膜組織細胞著色比較淺或無色，細胞膜和細胞質呈淡藍色、藍色或無色；在胃癌黏膜組織和癌旁黏膜組織細胞著色較深，細胞質中分散有呈淺黃色、黃色或棕黃色顆粒（圖1 g-i）。

2.2 3組mTOR、p70S6K、Lgr5蛋白陽性表達率比較 胃癌組織、癌旁組織mTOR、p70S6K、Lgr5蛋白陽性表達率高於正常胃黏膜組織，且胃癌組織高於癌旁組織，差異均有統計學意義(P<0.01)。見表1。

2.3mTOR、p70S6K、Lgr5蛋白陽性表達與胃癌患者臨床病理特徵的關係 不同性別，年齡≥50歲與<50歲胃癌患者mTOR、p70S6K、Lgr5陽性表達率比較差異無統計學意義(P>0.05)；腫瘤直徑≥5 cm與<5 cm者，TNM分期I+Ⅱ期與Ⅲ+Ⅳ期者，組織學分級Gi+G2期與G3+G4期者，淋巴結轉移N0者與Nl+N2+N3者，侵犯程度T1+T2期者與T3+T4期者mTOR、p70S6K、Lgr5陽性表達率比較差異均有統計學意義(P<0.01)。見表2。

2.4 胃癌組織中Lgr5蛋白與mTOR、p70S6K蛋白表達的相關性分析 Pearson相關分析結果表明，胃癌組織中Lgr5蛋白表達與mTOR蛋白表達呈正相關(r—0. 579，P=O. 004 6)，與p70S6K蛋白表達也呈正相關(r=0. 502，P=O. 0071)。

3討 論

mTORlp70S6K信號通路的異常與多種腫瘤密切相關。各種細胞信號包括促有絲分裂原、生長因子、營養成分、細胞能量狀態等均可對mTORlp70S6K信號通路產生影響。Lgr5作為一種腫瘤幹細胞，是腫瘤複發、轉移以及治療效果觀察的主要指標之一。Lgr5陽性的幽門部胃幹細胞是由Wnt信號通路引起胃癌發生的細胞學基礎。本研究結果顯示，mTOR、p70S6K、Lgr5蛋白在胃癌組織陽性表達率高於癌旁組織和正常胃黏膜組織，與mTORlp70S6K信號通路參與腫瘤細胞的發生、發展有關。惡性轉化腫瘤細胞中編碼mTOR信號通路相關蛋白的基因發生突變、蛋白異常表達，引起mTOR通路過度激活，並使腫瘤幹細胞Lgr5進一步活化，從而引起胃癌組織細胞中mTOR、p70S6K和Lgr5蛋白表達增高。

本研究結果顯示，mTOR、p70S6K、Lgr5蛋白陽性表達率在腫瘤直徑、TNM分期、組織學分級、有無淋巴結轉移、不同侵犯程度上差異有統計學意義，說明mTOR、p70S6K、Lgr5蛋白陽性表達與腫瘤直徑、組織浸潤程度、淋巴結轉移或遠端轉移關係密切，隨腫瘤增大、組織浸潤程度深度增加、淋巴轉移或遠端轉移增多，mTOR、p-OS6K、Lgr5蛋白陽性表達率增高。因此，mTOR、p70S6K、Lgr5蛋白陽性表達的胃癌患者預後較mTOR、p70S6K、Lgr5蛋白陰性表達患者差，且其表達與胃癌淋巴結轉移和疾病進展密切相關。本研究結果顯示，胃癌組織中Lgr5蛋白表達與mTOR蛋白表達呈正相關，與p70S6K蛋白表達呈正相關，說明mTORlp70S6K信號通路在胃癌組織中過度活化可進一步調控Lgr5的自我更新和多向分化發展，Lgr5也可能進一步促進mTORlp70S6K信號通路活化，二者具有協同作用，在胃癌的發展、血管生成、侵襲、轉移中起重要作用。目前臨床治療胃癌的方法比較單一，胃鏡不適用於胃癌的大規模篩查，而Lgr5、mTOR、p70S6K與胃癌患者預後相關，並可作為胃癌診斷的分子標誌物，在胃癌診斷及預後評估中具有重要價值。

來源：選自醫學空間戰略合作夥伴《中華實用診斷與治療》雜誌，2017，31（5）：423-426，轉載請標明出處！

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