體外診斷產品相關原材料（四）

最新 07-13

編者按

作者簡介

奚蘇靜

《中國體外診斷產業發展藍皮書》編委

海肽生物科技（上海）有限公司總經理

HyTest 全球戰略發展團隊成員

浙江大學，上海交通大學工商管理碩士

專註上游原料領域服務診斷產業十餘載。

2011年開始籌辦HyTest 中國全資子公司，經過數年的悉心經營，海肽生物已經成長為國內免疫診斷原料的領先企業之一。

四、載體

1，免疫層析技術

快速診斷試紙條是20世紀90年代在單克隆抗體技術、膠體金免疫層析技術和新材料技術基礎上發展起來的一項新型體外診斷技術，具有快速、簡便、單人份檢測、經濟的優點（圖1）,現已廣泛應用於醫學檢測、食品質量監測、環境監測、農業和畜牧業、出入境檢驗檢疫、法醫定案等領域。

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膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術以大孔徑的微孔濾膜（NC膜，硝酸纖維素膜）為載體，將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在NC膜上，當待測樣品加到試紙條一端的樣品墊上後，通過毛細作用向前移動，與結合墊上的膠體金標記試劑發生特異的免疫反應，再移動到NC膜上，被固定在NC膜表面的抗原或抗體捕獲，聚集在檢測帶上，通過目測硝酸纖維素表面標記物（膠體金或乳膠顆粒）的光反射信號的密度得到直觀的顯色結果。其它未結合的標記物則越過檢測帶，流入吸水墊中，達到自動分離的目的（圖2）。

2.膜的挑選與關鍵性能指標

蛋白結合能力

對於側向層析試紙條，硝酸纖維素高分子聚合物的表面積決定了有多少蛋白可以固定於NC膜上。NC膜的表面積主要由膜的孔徑、成孔率（膜的單位體積內的空氣百分比含量）、厚度以及多孔結構所決定。在其他參數都相同的條件下，膜的表面積與孔徑呈非線性反比關係；與厚度成線性正比關係；與成孔率呈非線性正比關係。以孔徑0.1um硝酸纖維素膜為例，它的表面積是孔徑10um濾膜的10倍，而非100倍。由膜的多孔結構形成的總表面積通常用m2/g表示，膜的基重容易測量，用g/ m2表示，二者相乘即比表面積，可表示為：內部總表面積/膜的平面面積。對於孔徑非常小的膜（如：0.1um濾膜），比表面積可達2000，而對用於側向層析上的大孔徑的膜，比表面積通常在50-200範圍內。

NC膜與蛋白的結合能力主要由蛋白的斯托克斯半徑及三維結構決定。以IgG為例，蛋白載量約為1μg/cm2，用蛋白載量（1μg/cm2）乘以層析膜的比表面積（50-200）可以估算出單位面積IgG與NC膜的結合量約為50-200μg/cm2。如果試紙條寬1cm，T線寬度1mm，那麼IgG的結合量約為5-20μg （0.1 cm 寬 x 1 cm 長 = 0.1 cm2)。由此可見，NC膜對於IgG的靜態結合能力約為市場上大部分檢測項目要求的10-100倍，NC膜對蛋白的結合能力完全可以滿足IVD生產企業的要求。

硝酸纖維素膜主要通過靜電吸附作用與蛋白結合（圖3）。儘管硝酸纖維素屬中性，其與蛋白的結合不受pH值的影響，但是pH值仍可通過影響蛋白在噴膜緩衝液中的穩定狀態進而影響蛋白與膜的結合。噴膜時，諸如Tween 20 和Triton X-100等離液劑應盡量避免，或者控制其使用濃度在0.01% v/v以下。這些物質會干擾蛋白與膜的結合，如果噴膜緩衝液中加入此類物質，可能會出現樣品流經T/C線時信號出現，隨後固定在NC膜上的抗原或抗體從膜上洗脫下來，信號消失的現象。如果出於降低非特異性結合或反應背景的目的需要加入離液劑，通常建議加在樣品墊中。

毛細流動速度

毛細流動速度通常指樣品的液流前鋒流經NC膜時的遷移速度。毛細流動速度比較難測量，隨著樣品遷移距離的加長，毛細流動速度開始逐漸變慢。為了便于衡量NC膜在側向層析中的整體表現，NC膜的生產廠商引入了毛細流動時間的概念。毛細流動時間體現的是液體在NC膜上遷移一定距離（通常為4cm）所用的時間。以默克HF135型號的膜為例，其含義是純水在50 +/- 5% R.H. and 21 +/- 1.5°C條件下流過4cm距離所用的時間是135秒。

NC膜的毛細流動速度對於側向層析試紙條的性能至關重要。默克是全球第一家生產側向層析膜的生產商，也是首家將毛細流動時間作為層析膜質量控制標準的公司。NC膜的毛細流動時間與試紙條的靈敏度關係如下（圖4）：

試紙條上的免疫反應是一個動態體系，在判讀結果的時候免疫反應並沒有達到平衡。C/T線上的信號強度取決於各個組分在分子水平上足夠接近，形成免疫複合物的有限時間。毛細流動速度決定了這一時間的長短。樣本中待檢物的有限濃度與毛細流動速度的平方呈反比（圖5）。例如，當毛細流動速度由X增加到1.25X時，樣本中待檢物的有效濃度則降低了36% (1-(1/1.252))。

此外，我們也可以用抗原抗體免疫複合物結合公式來理解這一概念。R表示在C/T線形成的抗原抗體複合物的總量，R等於K（抗原抗體的親和係數）乘以抗原和抗體的濃度，當流速為1X時，R = k[Ab][Ag]。假設流速由1X增加到2X，那麼抗原與抗體在分子水平上足夠接近形成免疫複合物的時間就縮短了一半，儘管抗原抗體的實際濃度沒有任何改變，但是他們的有效濃度均降低到原來的一半，用公式表示為：R = k[0.5 x Ab][0.5 x Ag] = 0.25 k[Ab][Ag]，相當於樣本中的待檢物濃度降低到原來的四分之一。因此，如果我們將流速為180秒/4cm（如HF180）的膜換成流速為90秒/4cm（如HF090）的膜，產品的靈敏度會降低4倍。在某些產品上，即便通過增加捕獲抗體或檢測抗體的濃度也難以彌補由於膜的流速加快而導致的靈敏度的降低。而且，通過增加抗體的使用量來提高產品靈敏度，會帶來產品成本上升，特異性下降等問題。

另一個需要考慮的因素是樣品在NC膜上的遷移速度會隨距離的加長而以指數方式降低。例如，樣品由X cm遷移到2X cm所用時間是從起點到X cm距離的2倍；也就是說如果樣品用1分鐘的時間從起點遷移到1cm距離，那麼遷移到下一個1cm所用的時間通常要2分鐘以上。因此，T線距離起點的位置對於層析試紙條的靈敏度有很大影響。T線的位置距離原點越遠，樣品到達T線位置時的速度越慢，樣品的有效濃度就越高，靈明度也相應越高。

既然樣品經過C/T線時的速度決定了其有效濃度，由於C線與T線不在同一位置，因此樣品中的待檢物與C線和T線的結合動力學也不盡相同。對於多重檢測項目（在同一試紙條上檢測兩種以上的待檢物）亦是如此。距離原點最近的T線由於樣品流速快，因此需要使用更多的捕獲抗體或檢測抗體。在設計產品的時出於成本考慮可以將抗原抗體親和係數較高的檢測項目放在最前面。

毛細流動速度除影響產品靈敏度外，也會在一定程度上改變C/T線的形態。C/T線在流速快的膜上線條較粗，在流速慢的膜上線條則較細。使用流速快的膜（如HF75）在檢測弱陽的樣本時可能會帶來一些問題，影響產品的最低檢出限度。

厚度

膜的厚度對於層析試紙條的影響主要有以下幾個方面，分別是：床體積、C/T線寬度、拉伸強度及C/T線信號的可視性。

床體積

如果試紙條不使用吸水墊，NC膜的床體積將決定可供檢測的樣品量，膜越厚，床體積也越大。對於1cm X 5cm，厚度為130μm的膜，其體積為0.065 cm3（長X寬X厚度），如果膜的成孔率為70%，那麼它的床體積應為：45.5 μL (0.7 x 65 μL)。如果NC膜的厚度由130μm變為110μm，那麼其床體積將減少為38.5 μL；相反，如果NC膜的厚度變為130μm，其床體積將增加到52.5 μL。因此，如果沒有吸水墊，NC膜厚度的改變將顯著影響可供檢測的樣品量。當然，如果試紙條使用吸水墊，則待檢的樣品量主要由吸水墊的床體積決定。

C/T線寬度

膜的厚度也會影響C/T線的寬度。如果噴膜的體積一定，則越薄的膜，C/T線越寬，越厚的膜C/T線越窄。由於抗原或抗體的使用量沒有改變，因此，越薄的膜，側向擴散距離越遠，在C/T線上產生的信號強度也會越低，進而影響試紙條的靈敏度。

拉伸強度

拉伸強度指在多大的力作用下可以將膜拉斷，通常NC膜的孔徑越大，厚度越薄則越容易拉斷。用於層析的NC膜屬於大孔徑的膜，因此，如果沒有背襯，此類膜較其它材質的膜更容易損壞。側向層析膜的拉伸強度通常介於1.75到8.8牛頓/cm之間。帶有背襯的NC膜很好的克服了這一缺點，與不帶背襯的NC膜相比更易操作，降低了用戶的生產損耗率。

C/T線信號的可視性

厚的膜能夠吸收更多的樣品，增加了到達C/T線的樣品總量，因此，靈敏度也應該更高。但是這一優勢被NC膜的固有性質所抵消。由於NC膜的光學特點，人的肉眼只能觀測到膜表面10μm以內的區域（圖6），用公式表示如下：%肉眼觀測信號=可見深度（10μm）/膜的厚度。越厚的膜，肉眼可見信號的百分比也越低。這足以抵消掉由於床體積增加帶來的靈敏度的提升。

表面活性劑

NC主要由硝酸纖維素的高分子聚合物組成，硝酸纖維素是疏水的，為了使膜能夠潤濕，需要在NC膜的生產過程中加入表面活性劑，表面活性劑對層析膜的性能影響主要表現在以下幾個方面（圖7）：

影響毛細流動速度

為了使膜能夠潤濕，通常需要加入一定濃度的表面活性劑。如果在此基礎上繼續提高表面活性劑的濃度，液體側向流動的均一性會有所改善，但是膜的潤濕性能幾乎不會有任何變化。通常，表面活性劑的種類及使用濃度對於特定的NC膜生產商來說是相對固定的。

影響蛋白吸附

表面活性劑無論從NC膜還是噴膜緩衝液的角度講都會對蛋白吸附造成影響。如果NC的表面活性劑濃度過高，會妨礙蛋白與NC膜的結合。噴膜緩衝液中的表面活性劑濃度對蛋白結合影響更大。以生產上常用的Tween R 20、Triton X-100、PVA、PVP、PEG等表面活性劑為例，其主要通過與NC膜或者抗原/抗體結合來降低蛋白與膜的結合能力，特別是當表面活性劑的使用濃度高於CMC（臨界膠束濃度）濃度時尤為如此。如果表面活性劑作為封閉劑的組成成分必須添加到系統中，通常建議使用的濃度越低越好，以防止表面活性劑將固定到膜上的抗原或抗體置換下來。表面活性劑推薦濃度如下：Tween R /Triton X-100 20為0.05% v/v；PVA, PVP和PEG為< 0.5% w/v。

對於噴膜過程及線條寬度的影響

噴膜過程的均一性受到NC膜潤濕性能的影響。提高表面活性劑的使用濃度可以改善液體側向流動的均一性，進而改善C/T線的線條寬度。然而，如果表面活性劑濃度過高，噴膜時的水線也會變寬。需要特別指出的是，水線與抗原/抗體結合到膜上形成的C/T蛋白線是兩個概念，在絕大多數情況下，抗原/抗體分子與NC膜高分子聚合物的結合是瞬時發生的，只有噴膜緩衝液中的化學試劑組分或者被化學封閉的蛋白才會在液體的毛細作用下向C/T線條的上下兩個方向側向遷移。我們在噴膜過程中看到的水線往往比C/T蛋白線要寬一些，水線的寬窄無法準確預測蛋白線條的質量。

NC膜的儲存條件

NC膜保存時應避免與易揮發的有機溶劑接觸，有機溶劑可與NC膜結合使膜變得疏水而無法使用。我們推薦的長期儲存條件為10-25℃, 30-70% RH（相對濕度），產品應放置於陰涼、乾燥、通風的環境，避免陽光直射造成局部過熱。

免疫層析技術熱點與新方向

隨著免疫層析技術的飛速發展，定量、高靈敏度、多元檢測、層析系統集成化，開始成為該領域新的研究方向，彩色微球、熒光微球以及磁珠已經成為繼膠體金之後的新一代抗原/抗體標記物。與傳統的膠體金相比，乳膠微球及磁珠具有良好的穩定性，線性範圍寬，靈敏度高，非常適用於定量免疫層析檢測中。

根據免疫層析試紙條所選標記物直徑的不同，NC膜的適應性也有所不同。如果選擇直徑較大的乳膠顆粒（300-400nm），則只能選擇孔徑稍大，流速在HF135以下的NC膜，不同粒徑的標記物在NC膜上的流動情況如下（圖8）：

圖4.9-18不同粒徑的標記物在Hi-Flow PlusTM系列硝酸纖維素膜上的流動情況

以目前市場上應用最為廣泛的熒光微球（圖9）為例，製作微球最為常用的材質為聚苯乙烯（PS）材料，熒光染料先通過膨脹的方法鑲嵌在微球孔隙中，再使微球收縮，用物理的方法將染料不可逆地包埋在微球內部。對於無任何功能基團修飾的微球，抗原或抗體通過被動吸附作用固定在微球表面。對於有功能基團修飾的微球，抗原/抗體可通過共價交聯的方式固定在微球表面。抗原/抗體的共價交聯方法主要有兩種，一種是兩步法，交聯前微球需先進行NHS/EDC活化，如-COOH羧基修飾的微球多採用此種方法；另一種是一步法，微球交聯前只需更換緩衝液的pH值即可活化，操作方便，如新一代的-Tosyl、-CH2Cl修飾的微球就屬此類。在產品開發初期，建議挑選三種不同粒徑的微球（如最為常用的100nm、300nm、500nm等）同時進行評估，以確定最佳微球尺寸。隨後對於選定的微球可以再選取不同濃度的功能基團（可分為高、中、低三檔）以確定最佳的功能基團濃度。挑選微球過程中應關注以下幾個方面：

l 微球熒光強度高、均一性好，在效期內穩定性好。

l 供應商能夠提供多種粒徑供選擇（50nm-500nm）

l 功能基團選擇靈活，如COOH、NH2、CH2Cl等，

l 有多重熒光供選擇以滿足不同激發光源需求（如U、X、XC、Y、Z等）

l 客戶批次驗證合格後，供應商可依客戶需求為客戶保留相應批次。