專題筆談│原發性免疫缺陷病分子診斷及新發原發性免疫缺陷病

摘要

原發性免疫缺陷病（PID）是免疫系統1個或多個要素缺陷所致的一類罕見病，大多數PID為單基因遺傳病。由於遺傳的多效性與異質性，明確的分子診斷對PID精準診治非常重要。Sanger測序和下一代測序（NGS）是PID分子診斷的主要工具。前者是檢測單個基因以及驗證NGS結果的金標準。NGS越來越多地應用於臨床，但對生物信息分析的要求較高。二者各有優勢與不足，需合理結合、揚長避短，才能發揮最優作用。PID分子診斷的4步法策略值得借鑒。另外，對NGS的臨床應用和PID分子診斷髮展的一些建議也值得學習。

關鍵詞

原發性免疫缺陷病；分子診斷；Sanger測序；下一代測序；全外顯子組測序；全基因組測序

作者單位：香港大學深圳醫院兒科 深圳市原發性免疫缺陷病診治技術工程實驗室 香港大學兒童與青少年醫學系，廣東 深圳 518053

通訊作者：毛華偉，電子信箱：maohw@hku-szh.org

原發性免疫缺陷病（primary immunodeficiency diseases，PID）是機體免疫系統1個或多個要素缺陷所致的一類罕見免疫遺傳性疾病。據國際免疫學會聯合會2015年分類，PID共分為9大類，其中每一大類又包括多種疾病［1］。自1952年發現Bruton無丙種球蛋白血症以來，全球已發現300多種基因缺陷所致的PID。根據生物功能及生物信息學分析，預估大概有3110個基因可能為PID致病基因［2］。因此，從整個PID領域來講，還有大量新的致病基因有待鑒定。

根據人口統計,每年我國有16 000 000～18 000 000嬰兒出生，按PID總發病率約為1/5000計算，其中應有3000～4000例新發PID病例。粗略估計目前我國PID患兒有60 000～120 000例［3］。由於PID種類繁多、異質性強，明確診斷較為困難。目前我國PID確診率不足5%。大部分PID患兒未被確診，沒有接受針對性管理，最終導致死亡。因此，明確診斷PID是目前學科的重要任務之一。

1 原發性免疫缺陷病分子診斷的必要性和意義

臨床對PID的認識經歷了半個多世紀。早期報道的PID往往具有完全的外顯率，隨著病例增多，現在越來越清楚部分PID病例具有不同的臨床表現程度，經常外顯不全。另一方面，PID往往缺乏明顯的基因型與表型相關性，同一基因不同突變可導致不同的臨床與免疫表型（遺傳多效性），而不同的基因突變又可導致相似的臨床表型（遺傳異質性）。如RAG1、RAG2基因突變可導致重症聯合免疫缺陷病（SCID）、Omenn綜合征、聯合免疫缺陷或自身免疫［4］。而Omenn綜合征，可由多個基因的亞效突變導致，如RAG1、RAG2、ARTEMIS、IL7RA、RMRP、ADA、LIG4、IL2RG、JAK3及AK2等基因。因此，明確的分子診斷對PID的正確認識、精準診治非常重要。

目前，個性化醫療已成為醫學發展的重點方向之一。2015年美國提出精準醫學，隨後我國結合國情也提出中國版的精準醫學計劃。所謂精準醫學，是應用現代基因組學、高通量基因下一代測序技術（NGS）、遺傳學、生物信息學以及生物學技術，結合患者臨床數據，實現疾病在基因水平的精準診斷，從而提供具有個性化的疾病治療和預防方案。在精準醫學的實施過程中，精準的基因診斷是整個計劃的主要目的之一，也是完成疾病精準治療的先決條件。只有精準的分子診斷，才能夠實現診治的精與准。

絕大多數PID為單基因病， 是實施精準醫學的最佳對象。明確PID的分子缺陷， 對於疾病管理具有重要意義。首先，可以避免遺傳多效性與異質性的干擾， 明確疾病診斷； 其次， 輔助患者家系進行遺傳諮詢和產前基因診斷； 另外， 對於部分具有明顯基因型-表型相關性的PID， 明確分子診斷後可以輔助預測疾病預後； 最後， 對於具有較差臨床結局的PID， 早期準確的分子診斷， 可以促使及時的針對性治療， 從而改善預後， 甚至扭轉疾病結局，比如X連鎖淋巴細胞異常增生症（XLP）、 家族性噬血細胞性淋巴組織細胞增生症（FHL）等［5］。

2 原發性免疫缺陷病分子診斷

儘管60多年前已能通過免疫學特徵鑒定PID，但直到近30年才能進行分子診斷。1953年，Watson和Crick提出DNA雙螺旋結構模型，為研究DNA一級結構奠定了基礎。1977年，Sanger提出雙脫氧鏈終止原理測定核苷酸序列的方法［6］。1986年，以DNA鏈末端合成終止法原理的DNA自動熒光測序儀的發明［7］，革新了現代分子生物學，促進了PID的分子診斷。2008年NGS的發明［8］，大大加速了既往未知遺傳基因突變的鑒定，NGS包括全外顯子組測序（WES）和全基因組測序（WGS）。自NGS發明以來，全球多國即積極利用該技術進行相關疾病病因研究。2008年5月，美國國立衛生研究院（NIH）啟動「未確診疾病計劃」，開始前所未有的規模向臨床提供基因組學服務。2009年，筆者所在課題組即啟動了「PID遺傳缺陷專項研究」，開始利用WES進行PID致病基因研究，輔助疾病的精準診斷與臨床管理［9-10］。

2.1Sanger測序傳統的PID基因診斷主要是理論知識驅動，根據患者臨床與免疫表型擬定可能的靶基因，然後逐一進行Sanger測序，從而鑒定致病基因突變。當臨床表型和疾病遺傳方式提示候選致病基因時，定向測序這些基因是最有效的方式。如男性患兒表現為濕疹、血小板減少及反覆感染，考慮濕疹血小板減少伴免疫缺陷綜合征（WAS），首先Sanger測序WASP基因，可明確分子診斷。另外，根據患者臨床表型與已知免疫學知識，加以綜合分析，也能鑒定未知病因PID的致病基因突變。如高IgM綜合征， 既往發現CD40L缺陷導致X-連鎖高IgM綜合征。另一方面，基礎免疫學知識提示CD40-CD40L相互作用在B細胞分化和免疫球蛋白類別轉化中有著重要作用，鑒於此，在常染色體隱性遺傳高IgM綜合征中發現CD40缺陷［11］。

動物疾病模型對PID的分子診斷也有借鑒作用。疾病動物模型能提示某個基因的生理功能，根據動物模型與患者表型的相似性，從而輔助PID分子診斷。比如1例表型類似WAS綜合征的女性患者，WASP基因正常。相似表型在WIP缺陷老鼠中曾有報道，而WIP蛋白由WIPF1基因編碼。因此靶向測序WIPF1基因發現了致病純合突變［12］。

在NGS發明前，PID的基因診斷主要是此種方法。其優點是高效、 無需大量計算資源。但由於PID疾病遺傳的多效性與異質性， 靶基因的選定並不容易。如前所述，多個基因突變均可導致Omenn綜合征，而Sanger測序多個靶基因，則耗時耗力，效率低，相對昂貴，也可能無法鑒定致病基因。另一方面，此種方法對新發PID、新的表型、複雜表型常無從下手，較難發現新的致病基因。

2.2下一代測序2014年12月國家衛計委批准一批臨床應用試點單位開展高通量基因測序技術對遺傳病進行基因診斷。2016年3月我國兩會期間「十三五」規劃綱要中明確提出「加速推動基因組學等生物技術大規模應用」。這些舉措必將大力促進NGS在PID領域的應用。

2.2.1下一代測序流程從臨床標本提取基因組DNA，打斷為小片段，與DNA鏈接片段相偶聯，通過與靶向DNA互補的DNA或RNA誘餌選取目標片段， 然後進行高通量並行測序。得到大量短序列數據， 與人類基因組參考序列比對， 進行註解。NGS可用於整個外顯子組的WES或整個基因組的WGS。前者需要捕獲過程，檢測蛋白編碼和RNA編碼基因；而後者無需捕獲， 檢測整個基因組， 包括內含子和調節區域。得到序列原始數據，經過一系列生物信息學分析，提出可能的候選基因，然後通過生物學功能實驗進行驗證，最終鑒定出致病基因突變。

2.2.2全外顯子組測序外顯子組包含20 000個蛋白編碼基因的所有外顯子。近年遺傳學表明，大多數單基因病的突變位於外顯子組區域。雖然外顯子組僅占基因組1%的序列，但包含了約85%的有害變異。並且，外顯子組在全基因組中最為保守，提示其生物學功能的重要性［13］。近期一項研究使用WES檢測PID患者致病基因突變，278例來自22個國家的病因不明患者，通過WES檢測，40%得到了明確的分子診斷，並且其中約一半患者臨床診斷得以修改，約1/4患者治療相應改變［14］。由此可見，WES在PID診治中具有重要作用。但WES也有缺陷，其只檢測編碼區，不包含內含子和調節區域。捕獲過程也是WES測序的致命弱點，因為捕獲或富集過程不能均勻覆蓋所有外顯子，從而引入一些偏倚。另外，對於複雜結構如缺失、插入、轉換、重複序列或重排，總體靈敏度低；如果靶基因與具有相似序列的假基因鄰近（如NCF1基因），基因定位也可能出錯［15-16］。

2.2.3多基因聯合高通量測序採用NGS技術對特定的多種基因進行高通量並行測序。目前科研機構和商業公司有針對已知PID相關基因、某個信號通路或某類特殊PID相關基因的測序試劑盒。相對WES而言，靶向多基因聯合測序策略數據分析量小、速度快，具有成本效益。並且靶向基因區測序深度可以比WES高，其檢測靈敏度好。多項研究採用此種方法檢測已知PID相關基因，都有較好的表現［17-18］。但其中個別基因，如NCF1，由於存在假基因或CG含量高等原因，導致覆蓋率低，因此不適合此方法檢測［16］。此種方法也有一定局限性，不能鑒定新基因；靶基因也需要經常更新，以期與發現的PID新基因保持同步。

2.2.4全基因組測序WGS檢測整個基因組，能鑒定新的致病基因。整個檢測程序不需要捕獲過程和文庫製備。相比WES具有明顯的技術優勢，可檢測內含子區和調節區域，且覆蓋度均一。另外，檢測諸如插入、缺失和轉座等結構變異也比WES更靈敏和準確。目前已有一些有關WGS用於PID分子診斷的報道［19］。但WGS費用較昂貴，大部分費用與測序有關。另外，雖然該技術提供大量序列數據，但從人類基因組32×108 bp中鑒別出致病基因突變非常困難，數據分析複雜，對生物信息分析要求很高。因此，對WGS的普遍應用還有待相關配套技術的成熟與完善。

2.2.5測序結果解讀通過NGS生成海量序列數據，解讀具有挑戰性。WGS得到4×106個左右單核苷酸變異，而每個外顯子組檢測出20 000～50 000個高質量的變異，其中包括單核苷酸多態性（SNP）、測序錯誤、非致病性變異和致病性突變［20］。如何從這些成千上萬的變異中選定最大可能的候選變異是巨大的挑戰，猶如大海撈針，需要逐步的生物信息學分析。首先，去除SNP資料庫和1000基因組資料庫存在的變異，保留錯義突變、無義突變、插入或缺失突變以及剪接突變等。再使用SIFT、PolyPhen2、MutationTaster等生物軟體進行功能分析，從而得到能導致生物功能變化的變異，這些即為可能的靶基因突變［9］。

生物信息分析只能預測變異的致病性。實際上，預測為有害的變異可能是中性變異；預測為良性變異的可能為功能損傷性突變；預測為功能缺失性突變也可能為功能獲得性突變［21］。因此，對於候選變異，還需要進一步開展生物學功能實驗，檢測對基因產物的表達或功能的影響，從而驗證其致病與否。

3 新發的原發性免疫缺陷病

國際免疫學會聯合會PID專家委員會基本每兩年召開1次會議， 討論更新PID的分類， 討論結果代表著最新最完全的已知PID疾病， 用作學界參考，並為PID的診斷提供了一個框架。隨著NGS的應用， 近年每年都會增加十多種新的PID。最近1次會議是2015年3月在英國倫敦召開， 會議通過了最新的PID分類［1］。此次會議增加的新的PID見表1。

4 原發性免疫缺陷病分子診斷的建議與展望

4.1分子診斷4步法策略PID致病基因的鑒定具有挑戰性，而免疫學、遺傳學、基因組學以及測序技術的飛速發展大大促進了PID的分子診斷。正確認識Sanger測序與NGS的優勢與不足，有機結合，揚長避短，才能發揮最大作用，為PID分子診斷所用。

鑒於此，筆者建議以下PID分子診斷4步法策略：第一，對於具有典型臨床與免疫表型的PID、或者臨床表型與基因型具有相關性的PID，建議Sanger測序相應候選致病基因；第二，臨床表型不典型的PID、具有多個致病基因的PID或者Sanger測序未能明確診斷的PID，建議NGS多基因（如PID相關基因）聯合測序；第三，新發PID或多基因聯合測序仍未明確分子診斷的PID，建議WES；第四，當考慮非編碼區突變和結構變異或WES無法明確診斷的PID，建議WGS。需要明確的是，對於測序得到的所有新基因突變，尤其非典型表型PID基因錯義突變，需要進行生物學功能驗證。

4.2分子診斷建議在NGS應用上，從成千上萬的NGS變異中選出候選突變，尤似大海撈針，需要注意以下事項：第一，進行NGS前，應對疾病遺傳方式、臨床表現外顯率及遺傳異質性等方面具有較好地認識，這決定了測序後分析策略以及候選基因的選擇。第二，由於在WES中不同區域的測序是不均勻的，因此，在實驗設計時，需平衡保證靶基因有足夠的覆蓋度。在多基因聯合高通量測序中，最好在最低測序深度時100%覆蓋所有靶向區域。第三，隨著測序技術的迅猛發展以及測序價格的逐步下降，大量商業公司以及部分學術機構紛紛開始提供NGS服務。目前，業界測序能力遠遠超過數據分析能力。開展高質量的生物信息分析、選定最有可能的候選基因變異成為了NGS是否成功的瓶頸因素。因此，需要大力提升生物信息分析能力，從而促進PID分子診斷的進步。第四，應用NGS時，需要具有免疫學、遺傳學與基因組學等相關知識的專家，保證該技術對疾病診斷的應用是合理準確的。

儘管PID的分子診斷已取得了長足進步，但在有些方面仍待提升。首先，表觀遺傳修飾，如DNA甲基化、組蛋白修飾及非編碼RNA可以調節基因表達，從而調節免疫系統［22］。這些機制的缺陷也可能導致PID。將來PID診斷也應在此方面加以挖掘。其次，儘管大部分PID為單基因遺傳病，但目前認為雙基因或多基因致病的比例在增加［23］。在應用NGS輔助PID分子診斷時，需要考慮此點，尤其在單個基因不能合理解釋患者整個生物學表型時。另外，基因組中僅1%的區域為外顯子組。依據PID種類，致病突變不在外顯子組的最大比例為5%～50%［24-25］。充分挖掘非編碼區致病突變，從而完善PID的分子診斷譜。

PID的分子檢測不僅可以提供精準的病因學診斷，輔助發展特異性的針對治療，還能輔助遺傳諮詢，對患者及家庭具有重要意義。有理由相信，在國家精準醫學的總體方針指導下，PID的分子診斷一定會有長足的進步與發展。

參考文獻 (略)

（2017-03-15收稿）

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