不同的靶基因擴增子在真菌多樣性研究中的比較

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周二文獻分享時間又來啦~今天小編跟大家分享一下《宏基因組測序揭示深古菌門中的甲烷代謝》文獻，一起來學學哦~~~

不同的靶基因擴增子在真菌多樣性研究中的比較

Different amplicon targets for sequencing-based studies of fungal diversity

雜誌：applied and environmental microbiology 時間：2017年6月 IF:3.807

研究背景

1、真菌在許多不同的環境中是非常重要的，為了解決微生物生態學中的基本生物學問題，對其結構進行準確和詳細的描述是必須的；

2、基於高通量測序技術的環境樣品分析，可以直接得到微生物種類的丰度信息，克服了基於培養所施加的限制，然而，由於實驗方法和生物信息分析也引入了偏差；

3、豐富的公共資料庫使得使用分類學相關基因測序研究不同環境中微生物群落的組成變得越來越方便；

4、ITS 1-2廣泛用於真菌群落分析，然而，ITS 1-2的長度在不同屬和種的真菌之間是多變的，因此從環境DNA中擴增該基因會存在優先擴增並對物種丰度的評估產生偏差。

研究方法

1、引物選擇與評估：作者挑選了用於擴增18S rRNA 基因V4 區、26S rRNA 基因D1/D2 區以及ITS1-2的三對引物，並通過過濾一些模糊的數據，只保留注釋為真菌的序列且涵蓋所有真菌系譜的資料庫，用於評估引物的特異性和分類學上的覆蓋度；

2、挑選已經測序過整個ITS區域的真菌進行分離培養和DNA提取；

3、DNA提取後，為了評估共同擴增偏好（co-amplification biases）帶來的影響並確保使用的引物能夠檢測所有包含的物種，採用了下圖中兩種不同的方案進行擴增建庫；

4、用已知的19個真菌構建模擬群落，並進行建庫測序分析；

5、收集包括土壤、人類唾液、人類糞便和葡萄汁等真實的生物樣品用於比較分析。

研究設計的示意圖

研究結果

1、引物評估：

1）18S擴增子引物錯配數量較少，ITS1的上游引物錯配率最高；

2）所有的引物均顯示了對真菌有廣泛的覆蓋度，其中18S擴增子引物的分類學覆蓋度更高，ITS1上游引物分類學覆蓋度最低。

2、模擬真菌群落分析

1）Mock-Ampl樣品在真菌區系組成上沒有顯著差異（P> 0.05），所有靶基因擴增子都能夠檢測到19種所使用的已知的真菌。

2）所使用的菌株ITS1-2長度約在180bp至420bp之間。有趣的是，Mock-DNA樣品中，使用ITS擴增子，ITS1-2長度在約180bp和190bp的的酵母菌株M. pulcherrima和P.kluyveri的丰度表現得過高；而ITS1-2約400 bpZygosacharomyces bailii和Hanseniasporan guillermondii丰度明顯被低估。

3）不論使用何種靶基因擴增子，Mock-Ampl樣品均顯示出與理論上相似的群落組成。多元方差分析檢測到Mock-DNA樣品中不同靶基因擴增子之間，真菌群落的總體組成存在差異。

4）與其它靶基因擴增子相比，26S和18S之間的平均Bray-Curtis距離較低，而ITS得到差異最大的結果。

5）PCA分析顯示：Mock-DNA樣品中不同的靶基因有明顯單獨的聚類；而Mock-Ampl樣品，不管使用什麼靶基因擴增子，都聚在一起。但是，所選擇的靶基因似乎沒有影響α-多樣性指數。

用三種不同靶基因擴增子在模擬群落中鑒定的真菌種類的相對丰度。期望丰度（理論值）顯示在最左邊。結果為2個（Mock-Ampl）或4個（Mock-DNA）重複的平均丰度。

基於種水平的微生物群落主成分分析

6）在Mock-DNA樣品中，模擬群落中的一些物種未被鑒定到，或者低於預期的丰度。下表是Mock-DNA樣品中，通過三個不同靶基因擴增子分析顯示出具有顯著差異的種。Metschnikowia pulcherrima在26S rRNA和ITS測序分析中被高估，而Candida zeylanoides和Pichia anomala在三個靶基因擴增子分析中都被低估。此外，Candida zemplinina僅在26S rRNA測序分析中被檢測到。