分子診斷——體外診斷技術發展的飛躍

作者：王華梁

單位：上海市臨床檢驗中心

自公元前300年，希波克拉底提倡尿液檢查診斷疾病以來，距今已有2 300餘年的歷史，但真正在臨床上能夠發揮重要作用的實驗室檢查不過數百年時間，主要原因是受限於體外診斷技術的發展與應用。沒有相應的科技進步和發展，實驗室檢測不可能取得突破。所幸的是，近百年來體外診斷技術取得了令人矚目的重大發展。目前，實驗室檢查對診斷、治療、預後等臨床醫療決策的貢獻度越來越高，尤其是近年來分子診斷技術的飛速發展，使得體外診斷技術再次實現革命性突破，分子診斷技術已覆蓋了腫瘤[1]、遺傳病[2]、血液病[3]、感染性疾病[4]、神經精神性疾病[5]、器官移植[6]、出生缺陷[7]等多個領域，其檢查結果對機體易感性評估、疾病診斷、預後、治療監測、個體化藥物治療、遺傳諮詢、健康管理以及家庭生育計劃制定等均具有重要的參考價值甚至決定性價值。醫學實驗室的重要性比歷史上任何時候都更加突顯。

回顧歷史，體外診斷技術的發展可謂既蜿蜒曲折，又引人入勝。公元1300年，尿檢在歐洲普及(此時距希波克拉底提倡尿檢已過去了1 600年時間)。公元1500年，內科醫生開始使用尿液顏色比對圖進行直觀尿液分析，1590年荷蘭顯微鏡學家、微生物學家安東尼·列文虎克(Antony van Leeuwenhoek，1632—1723)利用自製的顯微鏡首次發現了微生物，觀察到肌纖維和微血管中血流，並於1684年出版了世界上第一本顯微鏡觀察下的細菌繪圖。1660年義大利學者Malpighi應用最原始的顯微鏡觀察到人類紅細胞，開闢了醫學領域中細胞形態學檢查的先河。至此，以形態學檢查為主的實驗活動已漸漸成型，醫學實驗的基礎逐步奠定。

化學技術的發展為體外診斷技術帶來一次革命性的進步，從此，實驗室檢查不僅僅是單純的形態學觀察和描述了，實驗室檢驗的內容和其臨床意義得到很大的豐富和發展。隨著化學的發展和一些先驅在生命科學領域的嘗試，人們認識到人體組織的某些現象可用化學方法識別，且這些現象對疾病診斷有幫助。這種"化學標誌"具有與其他臨床癥狀和體征同樣的價值[9]。

體外診斷技術的第二次革命源於人類對"酶"的認識和酶學技術的發展，1773年，義大利科學家學者斯帕蘭扎尼(Spallanzani，1729—1799)推斷胃液中一定含有某種消化肉塊的物質。1833年，法國學者培安和培洛里發現澱粉酶。1836年，德國馬普生物研究所科學家施旺(Schwann，1810—1882)從胃液中提取出了消化蛋白質的物質-胃蛋白酶，解開了消化之謎。1897年，德國化學家畢希納證明了活體酵素與非活體酵素的功能是相同的。並獲得了1907年諾貝爾化學獎。20世紀30年代，科學家們相繼提取出多種酶的蛋白質結晶，並證實酶是一類具有生物催化作用的蛋白質。20世紀80年代，美國科學家切赫(Cech，1947— )和奧爾特曼(Altman，1939— )發現少數RNA也具有生物催化作用。1938年，Somogyi發明了血清和尿液的澱粉酶臨床檢驗方法，Gutman發明了第一個酸性磷酸酶的檢驗方法，1954年，Kuby發明了血清肌酸磷酸激酶活性的實驗室方法，1955年，Wroblewski和LaDue發明了血清乳酸脫氫酶的檢驗方法，Karmen發明了天冬氨酸轉氨酶的檢驗方法。不僅僅是酶自身的測定，人體中一些其他化學成分如血糖的測定，也充分利用了酶的作用：煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的生成速率與葡萄糖濃度呈正比，在波長340 nm監測吸光度升高速率，從而可以計算出血清中葡萄糖濃度。這些設計精細的反應，足以反應酶學技術對體外診斷帶來的影響。

免疫學的發展和免疫技術的應用無疑為體外診斷技術帶來第三次革命。1905年Bechtold發現了免疫擴散的原理。1950年R.S.Yalow和Famine S. Berson發明了放射免疫分析法，1952年Poulik博士發明了免疫電泳，1959美國化學家R.S.耶洛和S.A.貝爾森提出利用同位素標記的與未標記的抗原同抗體發生競爭性抑制反應的放射性同位素體外微量分析方法，又稱競爭性飽和分析法。他們因此獲得1977年的諾貝爾生物醫學獎。1967年，Abelev證明用患者血清中提取的α-甲胎球蛋白可以檢驗患者是否患有睾丸惡性腫瘤。1971年瑞典學者Engvail和Perlmann，以及荷蘭學者Van Weerman和Schuurs分別報道了體液中微量物質的固相免疫測定方法ELISA。1975年單克隆抗體雜交瘤技術的問世。在此基礎上大量的單克隆抗體被製備出來，並廣泛應用於臨床。1980年，D.Colcher發現了CA-72血清腫瘤標誌物，主要應用於檢測直腸結腸癌。1981年，H.Koprowski發現了CA199，作為血清腫瘤標誌物主要是為了檢測胰腺癌，R.C.Bast發現了CA125應用於檢測卵巢癌。在之後的數十年里，這種採用抗原-抗體結合原理建立的各種檢測方法在臨床上廣泛應用，不僅用於測定機體自身的免疫功能，還能廣泛用於檢測各種腫瘤標記物、自身抗體、感染性疾病標誌物、激素等。

分子診斷技術的迅猛發展無疑是體外診斷技術第四次革命，1953年Watson和Crick提出脫氧核糖核酸的雙螺旋結構模型可謂是里程碑式的成果，為分子生物學的發展和分子診斷技術的進步奠定了堅實的理論基礎。他們與Wilkins因此分享了1962年的諾貝爾醫學獎(此處值得一提的是Rosalind Franklin 1920—1958，她率先拍攝到的DNA晶體照片，為雙螺旋結構的建立起到了決定性作用。但遺憾的是她並沒等到分享榮耀)。隨後分子生物學的研究進展可謂精彩紛呈，新技術新方法的研發以超乎想像的速度問世。自20世紀70—80年代，各種核酸雜交技術發展成熟並廣泛應用。具有代表性的是斑點雜交(dot blot)、southern blot、northern blot和原位雜交(in situ hybridization)，以及各種標記技術比如核素標記、熒游標記等在各實驗方法上的應用。1971年Khorana提出核酸體外擴增的設想，但是，當時的基因序列分析方法尚未成熟，對熱具有較強穩定性的DNA聚合酶還未發現，寡核苷酸引物的合成仍處在手工、半自動合成階段，這種想法似乎沒有任何實際意義。1985年，美國科學家Kary Mullis經過兩年的努力，發明了PCR技術，也因此而獲得1993年的諾貝爾化學獎。同期取得進展的另一項非常重要的技術是DNA測序技術，20世紀70年代末，美國生物化學家Walter Gilbert發明化學法、英國生物化學家Frederick Sanger發明採用同位素標記的雙脫氧終止法手動測序技術，使人類測定基因序列成為可能。兩位學者也於1980年獲得諾貝爾化學獎。80年代中期，自動測序儀問世(應用雙脫氧終止法原理、採用熒光素代替同位素並使用計算機圖像識別)，90年代中期，人們對DNA測序儀進行重大改進、採用集束化的毛細管電泳代替凝膠電泳，隨後發展出成本更低，通量更高，準確度更高、速度更快的高通量測序技術(high-throughput sequencing)，又稱"下一代"測序技術("next-generation"sequencing technology)，能一次並行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。在其發展過程中具有代表性的主要有大規模平行簽名測序(massively parallel signature sequencing, MPSS)、聚合酶克隆技術(Polony Sequencing)、454焦磷酸測序(454 pyrosequencing)、Illumina Solexa sequencing、ABI SOLiD sequencing、離子半導體測序(ion semiconductor sequencing)、DNA納米球測序(DNA nanoball sequencing)等。目前，DNA測序可進行全基因組關聯分析(genome-wide association study, GWAS)、外顯子測序、轉錄組測序、非編碼RNA(如miRNA)測序、甲基化測序等，新技術的應用，使人們對許多物種的基因組，包括外顯子、非編碼區、轉錄組和基因拷貝數變異有了更深入、更全面的認識。對生物性狀、疾病的解析也取得了重大的突破。在基礎生物學研究和在眾多的應用領域，如醫學診斷，生物技術，法醫生物學，系統生物學等中DNA測序已成為不可缺少的技術。除上述具有里程碑意義的進展外，分子生物學發展過程中，尤其重大的成就是作為人類歷史上最偉大的三大科學計劃之一的人類基因組計劃的提出以及人類基因組序列圖的完成(另兩個為曼哈頓原子彈計劃和阿波羅登月計劃)，以1999年12月，第22號染色體測序完成開始[10]，至2006年5月，1號染色體測序完成結束[11](余為2000年5月，21號染色體測序完成[12]；2001年12月，20號染色體測序完成[13]；2003年2月，14號染色體測序完成[14]；2003年6月，Y染色體測序完成[15]；2003年7月，7號染色體測序完成[16]；2003年10月，6號染色體測序完成[17]；2004年4月，13號和19號染色體測序完成[18,19]; 2004年5月，9號和10號染色體測序完成[19,20]; 2004年9月，5號染色體測序完成[21]; 2004年12月，16號染色體測序完成[22]; 2005年3月，X染色體測序完成[23]; 2005年4月，2號和4號染色體測序[24,25]; 2005年9月，18號染色體測序完成[26]; 2006年1月，8號染色體測序完成[27]; 2006年3月，11號，12號和15號染色體[28,29,30]；2006年4月，17號和3號染色體測序完成[31,32])，標誌著人類已解開自身基因組的全部序列。該計劃的完成對社會發展和人類自身影響的重要性無論怎樣強調都不過分，對醫學實驗的巨大影響是進一步帶動分子診斷技術的飛速發展。

除各種核酸分析技術外，質譜技術近年來也取得突飛猛進的發展，因為是檢測特徵性的小分子，有些專家把質譜技術歸類到廣義的分子診斷技術中。其基本原理是測量離子電荷/質量比，首先使樣品中各組分發生電離，生成不同荷質比的離子，然後經加速電場的作用，形成離子束，進入質量分析器，再利用電場和磁場使發生相反的速度色散，最後將它們分別聚焦而得到質譜圖，從而確定其質量。世界上第一台質譜儀是英國物理學家、化學家Francis William Aston(1877—1945)於19世紀20年代研製成功，他用這台裝置發現了多種元素同位素，研究了53個非放射性元素，發現了天然存在的287種核素中的212種等，並為此榮獲1922年諾貝爾化學獎。目前，液相色譜質譜聯用儀，電感應耦合等離子體質譜儀，富立葉變換質譜等已比較成熟。質譜分析法已廣泛地應用於化工、能源、藥物、刑偵、醫學等各個領域。用於生物醫藥領域的質譜具有靈敏度高、選擇性強、準確性好等特點，在檢驗醫學中可用於組分序列分析、結構分析、分子量測定、組分含量測定等。現已應用於核酸的檢測分析、小分子生物標誌物的檢測、大分子生物標誌物檢測、微生物鑒定、藥物分析等。

目前，分子診斷技術以其具有的靈敏度高、特異性強、簡便快速、可進行定性、定量檢測等優勢，已廣泛應用於疾病的預測、預防、預後、個體化藥物治療、產前篩查、遺傳性疾病、腫瘤、感染性疾病(包括細菌性感染、病毒性感染、寄生蟲、真菌、人畜共患疾病等)、神經精神性疾病等多個領域。實驗室檢測對臨床醫療決策的貢獻度進一步提升，檢驗結果的重要性也達到空前的高度。許多檢測結果已不僅僅是"輔助診斷"了，而是對臨床醫療決策具有決定性的意義。但事物的發展總是具有兩面性的，實驗室檢測結果對臨床重要性的提高，同時也不可避免的伴隨著實驗室面臨風險的提高，除了直接影響醫療決策外，還伴隨著臨床醫護和患者對實驗室檢測的期望值提高和檢測質量要求的提高。2015年8月，美國華盛頓州終審法院對一起由於染色體核型分析報告錯誤引起的醫療糾紛，經過長達5年的訴訟後，最終判罰承擔檢測的醫療機構和實驗室5 000萬美元的天價賠償，為醫學實驗室提供了一個鮮活的風險教育案例。醫學實驗室需進一步加強風險意識和風險管理，提高質量管理水平，從檢測前、中、後每個環節切實規範管理和操作。讓"每一個檢測數據都關乎一個生命"的理念深入到每名檢測人員的意識里和每個操作流程的環節中。也只有如此，才能使醫學實驗室的管理、質量和能力與當代醫學發展和科技進步相適宜，與臨床診斷、治療、預後、預測和健康管理等要求相適宜。

參考文獻略

來源：中華檢驗醫學雜誌