看曹雪濤院士如何做circRNA的研究！

肝細胞癌HCC是人類常見的惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤發病率排在第五位。由於早期診斷困難和對各種治療反應差，肝細胞癌的5年死亡率仍較高。儘管近年在肝癌的早期診斷和肝癌治療等方面的研究取得了很大的進展，肝癌的治療手段仍然是有限的。非編碼RNA在癌症生物學中起到重要的作用，提供潛在的肝癌治療靶點。一些內源性的非編碼RNA如circRNA『註：王澤峰的文章證實circRNA是可以編碼蛋白的，《厲害了Word哥！這篇文章顛覆了我對circRNAs的認知！》』，在發育、細胞功能和特定的病理學應答中起到重要作用，特別是circRNA可以作為microRNA海綿來調控基因表達『註：即circRNA的ceRNA機制：《轉錄組研究新時尚--ceRNA：一種全新的基因表達調控模式》』。研究失調的circRNA和它們在癌症中的功能引起越來越多的重視。

近日，肝臟領域頂尖雜誌Hepatology『IF=13.246』在線發表了題為「Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression」的文章，其中中科院院士曹雪濤和第二軍醫大學於益藝教授為通訊作者。

正文解讀

為了研究circRNA在肝細胞癌HCC組織中的表達情況，作者使用circRNA microArray分析了7對HCC組織樣本（7例HCC組織及其7對相應的正常組織作為對照），然後分別篩選出了在HCC組織中上調最多或者下調最多的10個circRNAs（Fig. 1A）。

好了，「海選」結束，開始初賽！於是作者又在來源於21個病人的HCC樣本中對上述20個circRNAs的表達情況進行了驗證，其中Fig. 1B展示了其中6個的表達情況。結果發現就circMTO1水平發揮穩定前後表現一致，於是我們的曹院士就翻了它的牌~~o(>_

接下來作者又放大了樣本量來繼續考驗circMTO1的表達情況，結果不負眾望，在261例HCC組織樣本中有228例（87.4%）明顯下調了（Fig. 2A&B），嗯，表現還是不錯滴！

儘管circARID1B, circFAM13B, 和circFARP2在HCC樣本中也有下調，但是初步結果顯示，沉默這些circRNAs對HCC細胞的生長沒有明顯的影響，而只有沉默circMTO1時才會明顯促進HCC細胞的增殖。於是曹院士更加堅定了只翻circMTO1牌子的決心！

因為上述實驗表明circMTO1在HCC組織中有明顯的下調，所以作者接下來研究了circMTO1是否與HCC病人的預後相關。作者通過組織原位雜交（In Situ Hybridization, ISH）分析了116例帶有生存數據的樣本，結果發現，與正常組織相比，circMTO1在HCC組織中也明顯降低了（Fig. 2C）。更重要的是，HCC組織中circMTO1表達越低，HCC病人的預後越差（Fig. 2D&E）。

以上結果表明circMTO1表達的降低與病人較差的預後相關。

因為circRNA主要是作為miRNA的sponge『吸附可以起功能的miRNAs來調控相應基因的表達』來起作用，所以作者接下來又試圖找到可以與circMTO1結合的miRNAs。通過miRnada（不知道這個資料庫的點擊這個：《研究miRNA，這些資料庫你必須得知道！ 常用資料庫匯總》）預測軟體海選出了99個可能會與circMTO1結合的miRNAs。為了確定到底是哪些miRNAs可以與circMTO1結合，作者又使用circMTO1特異性的探針進行了RIP（RNA in vivo precipitation）實驗對上述99個miRNAs進行篩選。作者主要分析了之前就報道的20個可以在HCC中起作用的miRNAs（miR-204, miR-760, miR-4476, miR-6876, miR-152, miR-3686, miR-3159, miR-199a, miR181a-2, miR-211, miR-218-2, miR-3155a, miR-6730, miR-15a, miR-199b, miR-223, miR-3156, miR-4286, miR-4302, miR-9），結果發現miR-9有明顯的富集（Fig. 3A&B），而其他miRNAs則沒有明顯的富集，於是確定了miR-9為circMTO1的結合miRNA（circMTO1終於選好媳婦了~）。

通過FISH實驗發現circMTO1確實可以與miR-9在胞質中共定位，不過與對照組相比，HCC樣本中的共定位明顯減少（Fig. 3C）。這表明circMTO1確實可以與miR-9在胞質中結合。

接下來研究了circMTO1與HCC進展的關係。為了選擇用來沉默或者過表達circMTO1的細胞系，作者檢測了8個細胞系中circMTO1和miR-9的表達情況，結果發現，SK-Hep1相比中circMTO1表達最低，miR-9表達最高，QGY-7701細胞中兩種RNA的表達都適中， HepG2和SMMC-7721細胞中的circMTO1表達較高，而miR-9的表達較低（Fig. S3A）。於是作者選擇了在HepG2和SMMC-7721細胞中敲減circMTO1，而在SK-Hep1和QGY-7701細胞中過表達circMTO1。作者在circMTO1的介面處設計了siRNA，在HepG2和SMMC-7721細胞中轉入siRNA後通過qPCR進行了檢測（Fig. S3B）。為了說明這個siRNA對其他circMTO1的變體或者線性的MTO1沒有影響，也對這些基因進行了qPCR檢測（Fig. S3C）。結果發現這個siRNA的特異性很好。另外還構建了circMTO1的過表達系統，在SK-Hep1和QGY-7701細胞中檢測發現可以有效過表達circMTO1（Fig. S3D）。

作者在HCC細胞中沉默circMTO1來研究其對HCC進展的影響以及與miR-9的相互作用（Fig. 4A）。在HepG2和SMMC-7721細胞中沉默circMTO1明顯促進了細胞增殖（Fig. 4B），增強了細胞的侵襲（Fig. 4C），並且減少了凋亡（Fig. 4D）。而在SK-Hep1和QGY-7701細胞中過表達circMTO1則明顯促進了細胞的凋亡（Fig. 4D）。另外在HepG2和SMMC-7721細胞中過表達miR-9與沉默circMTO1效果相似（Fig. 4B-D）。

另外作者還檢測了circMTO1的sponge功能，結果發現過表達和沉默circMTO1都不會影響miR-9的表達水平（Fig. S4A&B）。這說明circMTO1是通過sponge來抑制miR-9的功能的。

為了進一步證實circMTO1是否是通過sponge吸附miR-9來發揮抗腫瘤的作用的，作則又檢測了腫瘤抑制基因p21的表達情況，另外p21也是miR-9的靶基因（Fig. 4E&F），無論是沉默circMTO1還是轉入miR-9的mimics，在HCC細胞中都可以明顯減少p21的mRNA和蛋白水平。另外過表達circMTO1則可以增加p21的mRNA和蛋白水平。這說明circMTO1可能是通過防止p21被miR-9下調來行使其抗腫瘤作用的。

接下來的也是經典實驗，rescue實驗！既然沉默circMTO1會釋放部分miR-9出來起作用，那麼加入miR-9的inhibitor是不是由沉默circMTO1引起的變化又不起作用了呢？另外一個方向的rescue也可以過表達circMTO1的同時過表達mir-9，如果加上這個實驗會更完美，不過可能由於circRNA表達效率和miRNA表達效率相差會比較大，表型不會那麼明顯，所以作者也沒做這個實驗。由Fig. 5A-C可以看出，當加入miR-9的inhibitor時，p21的mRNA和蛋白水平都不再被下調了，另外circMTO1沉默也不再促進細胞增殖和抑制細胞凋亡了（Fig. 5D&E）。

以上數據足以表明，circMTO1是通過作為miR-9的sponge來抑制HCC進展的，另外是通過circMTO1/miR-9/p21信號軸來消除miR-9的致癌作用的。

要想提升文章檔次，體內實驗必不可少！所以作者又建立了一個HCC的裸鼠模型（SMMC-LTNM），然後通過尾靜脈注射了circMTO1的siRNAs，兩周之後發現，腫瘤生長加速了，血清中AFP的水平明顯增加了（Fig. 6A&B）。尾靜脈注射siRNAs48h後SMMC-LTNM的腫瘤組織中circMTO1和p21的表達水平就明顯減少了（Fig. 6C）。另外，內源性敲低circMTO1也會抑制p21及其下游CDK2的表達，而細胞侵襲和增殖的marker MMP2和PCNA則上調了（Fig. 6D）。這些數據表明circMTO1可以在體內抑制HCC的進展。

思路總結

本文思路如下：

1. 從臨床樣本出發，通過高通量晶元篩選結合qPCR驗證得到感興趣的circRNA；

2. 放大臨床樣本量確認該circRNA具有普遍性，這樣研究該circRNA才有意義；

3. 以circRNA的ceRNA機製為基礎展開研究。首先篩選得到circRNA結合的miRNA，然後檢測其下游靶基因，並結合rescue等實驗對該機制進行更深入準確的研究；

4. 體內驗證。

相信經常讀科研小助手文章的童鞋都會有似曾相識的趕腳，其實這就是類似於miRNA的研究思路。只不過機制不同而已。當然按照此套路做下來我們未必能發到hepatology上，人家畢竟是曹院士么！不過3-5分還是沒有壓力的！做circRNA的都可以參考本文設計實驗。

1 Han D, Li J, Wang H et al. Circular RNA MTO1 acts as the sponge of miR-9 to suppress hepatocellular carcinoma progression. Hepatology 2017.

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