細胞培養專題——常用細胞培養液

細胞培養專題——常用細胞培養液

在細胞培養過程中，除了培養基外，還經常用到一些平衡鹽溶液、消化液、pH調整液等。

一、平衡鹽溶液（balanced salt solution,BSS）：主要是由無機鹽、葡萄糖組成，它的作用是維持細胞滲透壓平衡，保持pH穩定及提供簡單的營養。主要用於取材時組織塊的漂洗、細胞的漂洗、配製其他試劑等。最簡單的BSS是Ringer。D-Hank s與Hank s的一個主要區別是前者不含有Ca2+、Mg2+，因此D-Hank s常用於配製胰酶溶液。Earle平衡液含有較高的NaHCO3(2.2g/L),適合於5%CO2 的培養條件，Hank s平衡液僅含有0.35g/L NaHCO3，不能用於5%CO2的環境，若放入CO2培養相，溶液將迅速變酸，使用時應注意。

配製溶液應使用雙蒸水或去離子水。如果配方中含有Ca2+、Mg2+，應當首先溶解這些成分。配好的平衡鹽溶液可以過濾除菌或高溫滅菌。

二、消化液：取材進行原代培養時常常需要將組織塊消化解離形成細胞懸液，傳代培養時也需要將貼壁細胞從瓶壁上消化下來，常用的消化液有胰酶（Trypsin）溶液和EDTA溶液，有時也用膠原酶（collagenase）溶液。

1、胰酶溶液：胰酶活性可用消化酪蛋白的能力表示，常見有1：125和1：250，即一份胰酶可消化125或250份酪蛋白。組織培養用胰酶溶液一般配製成0.1-0.25%濃度，配製時要用不含Ca2+ 、Mg2+及血清的平衡鹽溶液（如前面的D-Hank s），因為這些物質會對胰酶產生抑制作用。胰酶作用及溶解的最佳pH是8-9，配製胰酶溶液應將液體調至pH8左右，充分溶解，過濾除菌。過濾後可以再調只pH7.5，也可不調。

使用細胞清洗液配製胰酶消化液：含0.5%胰酶的細胞清洗液（100ml細胞清洗液加0.5g胰酶），過濾除菌，分裝於4度保存。

2、EDTA溶液：EDTA溶液也常用來解離細胞，它的作用機制是破壞細胞間的連接。對於一些貼壁特別牢固的細胞，還可以用EDTA和胰酶的混合液進行消化。EDTA溶液的使用濃度為0.02%，配製時應加鹼助溶，配製後可過濾除菌，也可高溫消毒滅菌。

3、膠原酶溶液：膠原酶在上皮類細胞原代培養時經常使用，膠原酶作用的對象是膠原組織，因此不容易對細胞產生損傷。膠原酶的使用濃度為0.1-0.3mg/L或200000U/L,作用的最佳pH為6.5。膠原酶不受Ca2+ 、Mg2+及血清的抑制，配製時可用PBS。

三、pH調整液:常用的有HEPES液和NaHCO3溶液。

1、NaHCO3溶液：NaHCO3是培養基中必須添加的成分，一般情況下按說明書的要求準確添加，以保證培養基在5%CO2的環境下pH達到設計標準。如果是封閉式培養，即不與5%CO2的環境發生交換達到平衡，所使用的培養基就不能按照說明書所要求加入NaHCO3。此時常用5.6%或7.4%的NaHCO3溶液調節培養基，使之達到所要求的pH環境。

2、HEPES溶液：是一種弱酸，中文名字是羥乙基哌秦乙硫磺酸，對細胞無毒性，主要作用是防止培養基pH迅速變動。在開放式培養條件下，觀察細胞時培養基脫離了5%CO2的環境，CO2 氣體迅速逸出，pH迅速升高，若加了HEPES，此時可以維持pH7.0左右。一般在進行克隆化培養時要添加HEPES。

四、抗生素:常用的是青鏈黴素，俗稱「雙抗溶液」。青黴素主要是對革蘭陽性菌有效，鏈黴素主要對革蘭陰性菌有效。加入這兩種抗生素可預防絕大多數細菌污染。通常使用青黴素終濃度0.007-0.008g/100ml,鏈黴素終濃度0.01g/100ml。一般配製成100倍濃縮液，可用PBS或培養基配製。

五、谷氨醯胺補充液:谷氨醯胺在細胞代謝過程中起重要作用，合成培養基中都要添加，由於谷氨醯胺在溶液中很不穩定容易降解，4℃下放置7天即可分解約50%，所以都是在使用前添加。配製好的培養液（含谷氨醯胺）在4℃放置2周以上時，要重新加入原來量的谷氨醯胺，故需單獨配製谷氨醯胺，以便臨時加入培養液內。谷氨醯胺使用終濃度為0.002mol/L。一般配製為100倍濃縮液，即濃度為200mmol/L（29.22g/L），配製時應加溫30℃，完全溶解後過濾除菌，分裝至小瓶，儲存於－20℃。使用時，在每100ml培養液中加入0.5~2ml谷氨醯胺濃縮液，終濃度為1~4mmol/L。

六、二肽谷氨醯胺（L-丙氨醯-L-谷氨醯胺）

在細胞培養液中L-谷氨醯胺是大部分細胞培養基的基本成分；而L-谷氨醯胺是一種並不穩定的氨基酸，在中性的水溶液中會自發降解；需要頻繁地補加L-谷氨醯胺。因而在培養操作過程中經常：

（1）頻繁打開蓋子，增加了破壞無菌狀態的可能性；

（2）過多的追加L-谷氨醯胺，增加了培養基中氨的毒性水平。

二肽谷氨醯胺在細胞培養中穩定而不降解,可高壓滅菌,釋放毒性氨最少!

二肽谷氨醯胺在細胞內被氨肽酶（E.C.3.4.11.2）所水解，產生L-谷氨醯胺和L-丙氨酸；因此在大部分細胞系統中二肽谷氨醯胺就可以象L-谷氨醯胺同樣有效地被利用。二肽谷氨醯胺是最優替代物，它無需適應；既可用於貼壁細胞培養，也適合於懸浮細胞的培養。

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