測序40年——漫談組裝

最新 06-29

從1977年Sanger發明「雙脫氧鏈終止法」DNA測序技術起，基因組神秘的面紗一點一點的被揭露，從小至幾千鹼基的噬菌體基因組到數百萬鹼基的細菌基因組，再到三十億鹼基的人類基因組，每一步都值得記錄在人類探索自然、認識自身的篇章中。而這些成果背後的重要一環——基因組組裝，無疑是一個在研究中足夠」美」的問題：既足夠簡明，可用短短的一段話來描述；又足夠深刻，值得數十年的持續研究。小編今天和大家分享基因組組裝的歷史以及前沿的發展。

Part 1.白雲生處

上面是計算機學家Staden關於序列拼接的描述，從中可以引申出我們如今經常使用的幾個術語：reads/overlap/contig。對於序列拼接的概念Staden進行了簡明的定義：通過讀取片段(reads)間的連接關係(overlap)構建出更長的連續性片段(contig)。

更進一步的組裝研究中，序列拼接問題被轉化為圖論中的路徑尋找問題：以點(node)代表測序序列，以邊(edge)代表連接關係，以路徑(path)代表的圖上點的定向行走(walk)。這裡面，最有代表性的兩種構圖方式即string圖和de Brujin圖。下面奉上兩張小編收藏多年的圖，非常好的闡述了string圖和de Brujin圖在基因組組裝中的應用原理。

圖1. Strings Graph in genome assembly[2]

圖2. De Brujin Graph in genome assembly[3]

Part 2.一往而深

提起基因組，最廣為人知的應該是人類基因組計劃了，2001年公布的人類基因組是這一計劃的里程碑事件。其中，大放光彩的Celera Assembler也成為基因組組裝的」初代機「[4]，whole genome shotgun的測序策略結合Overlap Layout Consensus的組裝策略，攻克了基因組學研究上的第一座高峰。

但是一代測序由於高昂的測序成本以及較低的測序通量，限制了其在更多、更大規模的基因組學研究中的應用。隨著二代高通量測序的應運而生，全基因組測序才成為科研人員廣泛使用的工具。以2005年出現的454測序儀和2008年出現的illumina測序儀為代表，短讀長、高通量的測序數據成為主流。而對於基因組組裝而言，與之而來的卻是短至幾十鹼基的測序片段帶來的拼接困境。

為此，研究人員發明了不同的文庫構建方法，以及改變了序列拼接的演算法。高深度＋多文庫的雙端測序策略結合de Brujin圖的組裝策略，成為新一代的組裝標杆。在這一風起雲湧的時代，華大基因以其SOAPdenovo[5]，以快打慢，打下了一片大大的江山（大霧）。

所謂一代版本一代神，雖然通過二代測序繪製了多物種的基因組草圖，但整體的連續性和完整性上仍存在較大不足。隨著三代單分子測序技術的出現，又再次煥發了OLC組裝策略的新春。基於Celera Assembler，研究人員適應三代測序數據形成了Hierarchical Genome Assembly Process(HGAP)的先糾錯再組裝的策略[6]。而二代測序並沒有因此退出組裝舞台，採用巧妙的文庫構建方法如全基因組染色體構象捕獲測序技術（Hi-C）、在DNA片段上加入高通量的barcode標籤測序技術(10X)等，能夠進一步對基因組進行完善升級，甚至使組裝結果達到染色體水平。

說起來，小編最初接觸組裝時深入研究的就是Celera Assembler，當時還是三代測序出現之初的7.0版本，見證了諸多版本的更新，不得不說，開發人員確實是一往而深（大霧），當為吾輩楷模。

Part 3.滄海雲帆

組裝的終極目標是得到一個沒有間隙(gap)的、單倍體精度的組裝結果，但是目前為止，還沒有一個高等動植物的基因組實現這樣的目標。即使是研究最完善的人類基因組，目前仍存在800餘個gaps。但是這個目標的實現距離我們已經是觸目可及了：測序技術不斷發展，一代、二代、三代、光學等數據優勢互補，使組裝如虎添翼；建庫方法不斷改進，Hi-C、10X等方法畫龍點睛，助組裝錦上添花。