腸道病毒71型阻斷RLR信號轉導通路機制研究進展

本文刊於：中華兒科雜誌, 2017,55(06): 475-478

作者：朱偉金 徐翼 譚麗梅 葉家衛

單位：廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心感染科

手足口病是由多種人腸道病毒(EV)感染引起的兒童常見傳染病，通常為自限性疾病，以發熱、口腔潰瘍、手足皰疹為主要癥狀，然而部分患者會進展為重症手足口病，可出現無菌性腦膜炎、腦炎、急性遲緩性麻痹、神經源性肺水腫等嚴重併發症，甚至導致死亡。腸道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)是引起重症手足口病的主要病原，但其引起重症手足口病的機制仍未清楚。現就EV71通過阻斷RIG-I樣受體(RIG-I-like receptors，RLRs)信號通路，從而抑制先天性免疫機制發揮其致病性的研究進展綜述如下。

一、先天性免疫對病毒的識別

模式識別受體(pattern recognition receptors，PRRs)是機體抵抗外界病原微生物感染的首條防線，是機體啟動先天性免疫應答的重要組成部分，在先天性抗病毒免疫過程中發揮著尤為重要的作用[1]。PRRs可以識別病毒的蛋白與核酸，機體細胞將這些病毒組分識別為"非己成分"，這些"非己成分"也被稱為"病原相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)"。PRRs與PAMPs識別並結合，誘導信號級聯反應，激活轉錄因子，進而激活特定的細胞因子和趨化因子的表達，其中最主要是誘導Ⅰ型干擾素(type Ⅰinterferon，IFN-Ⅰ)的產生[2]。隨後IFN-Ⅰ以自分泌或旁分泌的方式進一步啟動一系列的抗病毒反應，如誘導抗病毒蛋白的表達、誘導炎性因子的產生以及誘導細胞凋亡發生等方式清除細胞內的病毒。同時調控數百個干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的表達，從而改變細胞內環境和調節免疫反應[3,4]。由於病毒RNA在細胞漿內的異質性最高，因此其被PRRs識別的效率也最高，細胞也進化出一系列能夠特異性識別RNA片段的PRRs，其中包括識別內體、溶酶體內部和細胞外的RNA的Toll樣受體(Toll-like receptor，TLRs)家族分子，識別胞質內部RNA的RLRs家族分子RIG-I和MDA5[5]。近年研究表明，在RNA病毒天然免疫應答中大多數是通過RLR信號轉導通路激活與誘導IFN-Ⅰ表達[6]。

二、EV71分子結構

EV71是一種單股正鏈RNA病毒，屬於小RNA病毒家族。EV71病毒基因組為含有大約7 500個核苷酸的單一正鏈RNA，該基因組中僅有一個開放閱讀區(ORF)，編碼含2 193個核苷酸的多聚蛋白；該多聚蛋白在合成的同時，不斷被由其本身水解產生的蛋白酶所切割，可進一步被水解成P1、P2和P3三個前體蛋白。P1前體蛋白再經一系列的加工，最終形成VP1、VP2、VP3和VP4四個病毒結構蛋白，形成原聚體和亞單位，最終形成病毒的外殼。P2前體蛋白的切割產物包括2A、2B和2C。P3前體蛋白利用非濃度依賴性的自身切割等機制產生3A、3B、3C和3D，其中2A和3C蛋白酶被認為與EV71病毒的致病性有關[7]。

三、EV71在RLRs信號轉導通路進行拮抗的各階段

目前EV71的致病機制並不完全清楚，但抑制宿主先天性免疫反應被認為是其重要的致病機制之一[8,9,10]。RLRs信號通路通過級聯放大效應，誘導IFN-Ⅰ的表達，激活干擾素通路，在機體抵抗病毒感染過程中發揮著至關重要的作用。EV71病毒的RNA本質上具有誘導RLRs信號轉導通路產生IFN-Ⅰ的能力[11]，然而實際上EV71病毒抑制IFN-Ⅰ的產生，其原因在於EV71阻斷RLRs信號通路[12,13]。

1．識別與啟動階段：

機體大多細胞內RLRs表達水平較低，但病毒入侵後其會迅速增多，促進IFN的生成。在生理水平下，RLRs均沒有活性，其兩個級聯激活和招募結構域(caspase activation and recruitment domains, CARD)區通過C末端結構域(cterminal domain, CTD)和解旋酶中間的一個螯合抑制基序與Hel2i結合在一起，處於自我抑制狀態[14]。當PAMPs RNA與CTD區靠近後，螯合基序從Hel2i區脫離開來，打開RNA綁定區域並與之結合。接著PAMP RNA包裹到Hel區，RLRs發生二聚化，ATP酶活性被激活[15]。ATP的水解促進了RLRs二聚體向PAMPs RNA的轉移，然後RLRs的構象發生變化，N端CARD區被暴露出來，游離的CARD區與K63連接的多聚泛素結合，從而導致RLRs的寡聚化和轉運[16]，這是其構象進一步發生變化，使得RLRs的CARD結構域與信號轉導器線粒體抗病毒信號傳送蛋白(mitochondrial antiviral signaling protein，MAVS)的CARD結構域相互作用，開始信號的轉導[17,18]。

RLRs是胞質內的一種PRR，主要參與細胞內病毒RNA的識別[19,20]，主要包括：維甲酸誘導基因I(retinoic acid-induced gene I, RLG-I)和黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation-associated gene-5)。EV71能通過不同的方法和機制阻斷RLRs對其RNA的識別。在EV71體外感染實驗中發現，3C蛋白能抑制誘導IFN-Ⅰ產生的啟動子激活，而缺乏RIG-I受體細胞中EV71的3C蛋白並不能阻礙IFN-Ⅰ的表達；進一步實驗結果顯示感染細胞中RIG-I受體表達水平無改變，3C蛋白酶並未破壞RIG-I受體，而是通過氨基末端的結構域與RIG-I受體的半胱天冬酶招募結構域(caspase recruitment domain，CARD)結合，抑制RIG-I受體對MAVS的招募，從而抑制RLRs通路的激活，導致IFN-Ⅰ、ISGs等表達量下降[21]。黑色素瘤分化相關基因5(melanoma differentiation-associated gene-5，MDA5)最初被認為是識別小RNA病毒的主要受體，同時具有相似的CARD，但實驗同時發現3C蛋白酶卻不能阻礙MDA5與MAVS結合，甚至能夠促進MDA5激活，具體機制仍不清楚[21]。但是近期報道卻發現相反的結果，使用4種(MP4、TW2231、TW 98和BrCr)不同的EV71病毒株感染細胞，實驗顯示MDA5表達量也明顯下降，而不是RIG-I[11]；後續的研究利用重組體攜帶EV71病毒的2A蛋白酶基因轉入細胞內，發現MDA5被裂解成約100 kDa片段，證明EV71在複製過程中，2A蛋白酶攻擊MDA5[22]，導致其裂解而無法識別RNA，抑制RIG-I信號通路激活[23]。由此可見，EV71病毒拮抗RLRs的激活的策略多種多樣，確保抑制IFN-Ⅰ的表達，從而促進病毒的複製。

2．信號轉導與調控階段：

RIG-I/MDA5從胞漿向線粒體膜轉移並激活MAVS是RLRs信號傳遞所必需的，線粒體靶定伴侶分子14-3-3ε和泛素連接酶分子TRIM25a形成的轉位子在其重新定位中發揮著關鍵作用[24]。激活的RIG-I和MDA5通過CARD-CARD的相互作用與接頭蛋白MAVS作用，從而誘導下游信號分子的招募。激活後的MAVS形成朊病毒(Prion)樣的聚集體，和內質網上的干擾素刺激因子(stimulator of interferon genes，STING)結合，並招募下游的TRAF3，TRAF3進一步招募並活化TBK1/IKKε，TBK1/IKKε和TANK、NAP1、SINTBAD相結合，並活化轉錄因子IRF3和IRF7[25]。此外活化的MAVS還可以通過和Fas相關死亡域蛋白(fas-associated death domain-containing protein，FADD)、caspase8/10相互作用，活化NF-κB[24]。

信號轉導蛋白MAVS由540個氨基酸組成，在各種類型的免疫細胞及非免疫細胞中廣泛表達，是胞漿內膜識別受體RIG-I和MDA5所公用的、唯一的接頭分子，在二者所介導的天然免疫信號轉導過程中具有至關重要的作用[26]。許多病毒都被報道以MAVS為靶標拮抗宿主細胞天然免疫反應，包括柯薩奇病毒3[23]、丙型肝炎病毒[26]和乙型肝炎病毒[27]。EV71同樣能作用於MAVS以拮抗RIG-I信號通路。在EV71病毒體外感染實驗顯示，隨著感染時間的延長，MAVS的表達量降低，同時在30 kd左右出現兩條裂解條帶，而且隨感染時間延長而增強；後續實驗將重組的2A蛋白酶與HeLa細胞的全細胞裂解液進行孵育，可以產生與EV71感染細胞中大小一致的裂解條帶，且和2A蛋白酶呈劑量反應關係，提示EV71編碼的2A蛋白酶是導致MAVS發生裂解的因素[28]，且2A蛋白酶對MAVS的裂解依賴其酶學活性，與蛋白酶體無關[29]。進一步實驗發現EV71的2A蛋白酶作用於MAVS的裂解位點有3個，分別是Gly209、Gly251和Gly265，是多位點的酶解[30]。同時也有實驗顯示當將Myc-3C、Flag-RIG-I以及HA-MAVS同時轉染人類橫紋肌瘤細胞時，再行免疫共沉澱分析，能夠檢測到RIG-I與3C形成的免疫共沉澱複合物，而沒有檢測到RIG-I與MAVS形成的免疫共沉澱複合物，表明EV71的3C與RIG-I結合後，使RIG-I阻滯於沉默狀態，並且阻礙了RIG-I與其下游接頭蛋白MAVS的結合，從而抑制了RIG-I介導的信號轉導[31]。

3．效應階段：

在先天性免疫應答中IRF3/7和NF-κB是兩類重要的轉錄因子，活化的IRF3/7二聚體與NF-κB從胞漿進入細胞核內，促進並組合成IFN-Ⅰ啟動子，啟動IFN-Ⅰ相關基因的表達[32,33]；此外，IRF3/7進入細胞核後直接作為干擾素刺激基因(IFN stimulated genes，ISGs)的啟動子，促進早期ISGs表達，而NF-κB進入細胞核後啟動許多炎症因子、趨化因子和黏附分子的表達[34]，從而發揮抗病毒作用。自分泌和旁分泌的IFN-Ⅰ與細胞表面的IFNAR1和IFNAR2受體結合激活IFN信號通路，最終大量表達ISGs。這些基因促進病毒的清除和建立抗病毒狀態防止其再感染正常細胞，甚至引起已感染的細胞發生凋亡，它們還能激活巨噬細胞和樹突細胞等引起適應性免疫。

真核生物的細胞核由核膜包被，真核生物的基因複製、轉錄、蛋白翻譯及修飾這些基本的生命活動是在細胞的特定區域分區完成。因此，相關的核酸、蛋白質等分子跨越核膜在細胞核與細胞質之間穿梭對細胞執行正常的生物學功能尤為重要。而NPC是一個巨型蛋白質複合體，組成它的特徵性蛋白叫核孔素(nucleoporins，Nups)。哺乳動物細胞的NPC的中央通道蛋白由Nup62-Nup58-Nup54-Nup45組成。由於NPC的存在，各種分子穿梭核膜存在多種形式，如自由擴散、主動轉運、跨膜轉運等[35,36]。無論採取哪種途徑，這些分子必須直接或間接與Nups相互作用，才能實現轉運過程。早期實驗結果顯示，當單獨將GFP-IRF3轉染RD細胞，IRF3主要位於細胞質；將GFP-IRF3與RIG-IN共轉染時，IRF3主要位於細胞核中；但是將RIG-IN、GFP-IRF3與Myc-3C共轉染時，IRF3主要位於細胞質，核內的IRF3卻增加不明顯[31]，提示EV71病毒的3C蛋白酶阻礙RLR信號通路下游的重要轉錄因子IRF3的核轉移，抑制IFN-Ⅰ的產生；另外實驗結果發現感染EV71病毒的細胞內核轉運率明顯下降[37]，同時證明EV71病毒通過特異性2A蛋白酶切割Nup62導致核孔複合物跨膜轉運功能的障礙，因此造成IRF3/7與NF-κB進核障礙，最終導致IFN-Ⅰ等合成受到抑制[38]。這些研究結論證明EV71可以抑制磷酸化的IRF3進入細胞參與調控IFN-Ⅰ基因表達。

EV71的3C蛋白還被發現能夠攻擊另外一個重要的轉錄因子IRF7。實驗研究證明EV71的3C蛋白通過自身酶活性裂解IRF7，其裂解位點位於活性區域Q189-S190，不僅IRF7單體數量減少，而且IRF7的磷酸化和二聚體的形成均被顯著抑制，阻斷RLRs通路的信號傳導[39]。

總之，模式識別受體是宿主抵禦病原微生物感染的第一條防線，在宿主天然免疫系統中發揮著至關重要的作用。其通過快速對病原微生物的識別，啟動下游一系列級聯抗病毒效應，最終發揮清除病原微生物的作用。RLR信號轉導通路是天然免疫系統中非常重要的一部分，通過識別病毒RNA而啟動應答，誘導IFN-Ⅰ的產生，最終發揮抗病毒效應。而EV71通過不同的策略阻斷RLR信號轉導通路，這些策略通過不同的機制抑制IFN-Ⅰ產生效應，有利地促進了病毒的複製。對於EV71而言，一個新的拮抗策略的產生，可能使得宿主在短期內無法與其對抗，從而導致病毒大量複製，病毒感染大面積爆發。有待對EV71拮抗宿主天然免疫機制的進一步深入研究，為探討發病機制提供思路與依據。

參考文獻（略）

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