糖尿病腎病細胞模型三羧酸循環代謝異常和機制初探

本實驗採用PA體外刺激人腎小管上皮細胞（HK-2）的方法，探討由DN造成的代謝異常，找尋可能的指示物並為早期診斷DN提供研究基礎。

【基礎研究】糖尿病腎病細胞模型三羧酸循環代謝異常和機制初探

俞曉憶¹，周芷若²，謝媛¹，孫潤彬¹，費菲¹，高浩雪¹，黃京秋¹，阿基業¹，王廣基¹

1中國藥科大學藥科院藥物代謝動力學重點實驗室，南京 210046，江蘇；

2南京中醫藥大學藥學院藥效與安全性評價重點實驗室，南京 210023，江蘇

江蘇省科技計劃項目臨床醫學科技專項 (BL2014070)；國家自然科學基金項目 (81072692)；973 「國家重點基礎研究發展計劃資助」子課題 (2012CB517606)

俞曉憶，男，博士研究生，研究方向：藥物代謝動力學。

Tel: 13675138271

E-mail：yxyeventually@hotmail.com

王廣基，通信作者，男，博士，工程院院士，研究方向：藥物代謝動力學。

摘 要 目的：探討糖尿病腎病（DN）狀態下三羧酸（TCA）循環中間代謝產物的差異，觀察糖尿病腎病細胞模型中的代謝紊亂。方法：體外培養人腎小管上皮細胞（HK-2），分為對照組（control）、高糖組（high glucose）、棕櫚酸組（PA）、棕櫚酸複合高糖組（PA high glucose）。線粒體染色法觀察造模後的細胞損傷狀況，基於氣相的代謝組學方法檢測細胞模型中出現的代謝差異，並找出相關差異化合物。氣象色譜-質譜（GC-MS）定量方法進一步測定差異化合物的絕對濃度。qPCR測定差異化合物相關通路的酶表達。結果：12 h，24 h內高糖對HK-2細胞的損傷和代謝影響較弱，而棕櫚酸在短期內就可以造成腎臟細胞損傷和代謝紊亂，複合因素下的誘導效果更甚。造模細胞內出現的代謝異常中TCA循環佔主要部分，其中檸檬酸和琥珀酸水平出現異常升高。並且琥珀酸水平異常主要由其合成酶影響導致。結論：棕櫚酸誘導引起細胞中TCA循環代謝異常變化可能與DN相關。

關鍵詞糖尿病腎病；HK-2；棕櫚酸；琥珀酸

糖尿病腎病（diabetic nephropathy, DN）已經成為了糖尿病患者最主要的死亡原因之一，也是導致終末期腎病（End stage renal disease，ESRD）的主要原因之一。DN預後極差且一旦發生致死率極高^[1-3]。中醫理論認為糖尿病腎病本源來自於虛，虛和淤貫穿其始終^[4-5]。而西方發現DN在臨床上會出現比較明顯的腎小球濾過率（glomerular filtration rate, GFR）降低，以及白蛋白尿的升高^[6]。在各種類型的腎臟疾病中，出現蛋白尿的臨床現象被認為是晚期腎病的主要原因，並被認為是危及生命的疾病^{[1-3, 7]}。因此相對其他癥狀，治癒蛋白尿成為了治療蛋白尿類腎病的主要目標。但是臨床上GFR的測定較為繁瑣，且白蛋白尿的預測準確率不高，雖然在最新的臨床研究中，某些免疫抑製劑或抗高血壓葯被發現可以有效的降低蛋白尿^{[2, 8-10]}，但也很難延長腎病患者健康壽命及改善患者預後。所以為了防治DN的高發，對DN早期標誌物的發現與病理機制的探究顯得尤為必要。

在DN中蛋白尿的增加會損傷近曲小管細胞，導致嚴重的腎小管間質病變和隨後引發的腎功能不全^{[1, 7]}。因此減少腎小管細胞在蛋白尿狀態下的細胞毒性是DN蛋白尿藥物研製的目標。研究發現，肥胖也是蛋白尿的病因之一，同時是腎小球損傷以及病人腎功能快速下降的主要原因^[11-13]。肥胖會加劇蛋白尿誘導的腎小管間質病變^[14-15]，並且蛋白尿誘導的腎小管間質病變和腎臟最終的病變程度直接相關。在肥胖人群中，脂肪酸水平與反映肥胖的指數BMI等呈現顯著正相關^[16-17]，且遊離脂肪酸可以作為脂毒性介導的氧化應激導致腎小管的嚴重間質損害，特別在肥胖相關的疾病和DN^[18-21]。所以高脂肪酸與DN有著緊密的聯繫。近期研究表明脂肪酸誘導的近曲小管損傷的分子模型可以用來研究DN的分子機制，棕櫚酸（palmitic acid, PA）這種脂肪酸是胰島素活性的負調節劑，它可以抑制因胰島素刺激而引發的 Akt ser473 磷酸化，所以PA可以作為誘導腎臟損傷的誘導劑^[22-23]。

在本實驗中我們運用了棕櫚酸誘導DN的體外模型，但由於DN除了腎臟損傷機體細胞同時也會處於高糖的狀態，所以實驗附加高糖等其他因素以觀察DN狀態下的異常代謝方式，以及相關酶的變化趨勢。本實驗採用PA體外刺激人腎小管上皮細胞（HK-2）的方法，探討由DN造成的代謝異常，找尋可能的指示物並為早期診斷DN提供研究基礎。

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材料與方法

1.1 實驗材料人腎小管上皮細胞（HK-2），購自於武漢細胞庫；DF12培養基（DMEM和F12兩種培養基1:1混合，Gibco）；10%胎牛血清（FBS，Hyclone，Utah, USA）；青黴素、鏈黴素均購自於南京生興生物工程公司；1,2-13C2-肉寇酸（穩定的同位素內標， Sigma-Aldrich）；吡啶 (Sigma-Aldrich)，MSTFA含1% TMCS (MSTFA，N-甲基-N-三甲基硅烷三氟乙醯胺，Sigma-Aldrich)；甲醇、正庚烷 (Sigma-Aldrich)；超純水 (自製，Millipore，美國)；棕櫚酸、琥珀酸、葡萄糖 (Sigma-Aldrich)；鹽酸 (Sigma-Aldrich)；mito-Tracker Green (線粒體綠色熒光探針) 50 μg 購置於碧雲天。

1.2 實驗儀器SHIMADZU QP2010Ultra/SE GC-MS 系統裝配化學結合 Rxi-5MSd 的30 m×0.25 mm 彈性石英毛細管柱 (AOC-20S自動進樣系統)，Sovall Biofuge Stratos 高速冷凍離心機；Thermo 分體式真空離心濃縮揮干儀 ( Se250EXP, RVT400, OFP400) Bio-Tek Synergy H1多功能熒光酶標儀；Sovall Biofuge Stratos 高速冷凍離心機；定量PCR儀( Thermal Cycler DiceTM Real Time System，Takara，Japan)；XW-80A 台式渦旋振蕩器； Minispin小型高速離心機 (德國Eppendorf公司)；Thermo Savant SPD 2010 離心濃縮裝置 (Thermo Co，MA，USA)；Milli-Q Gradient A10 超純水機 (Millipore Inc. USA)；HL-2 恆溫水浴；Thermo IEC 低溫高速離心機 (Thermo CO， MA， USA)， Leica DMI3000B (Germany)萊卡熒光倒置顯微鏡。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模培養基的的配製 高糖誘導模型培養基：普通培養基的含糖量為4.5 mg/mL, 為了模擬高糖的病理狀態，我們將含糖量補足到8 mg/mL。

PA 誘導模型培養基：（1）配置PA的NaOH溶液：PA 38.463 mg，NaOH 6 mg，溶於1.5 mL超純水中，70 °C，反應1 h；（2）配置 PA 的牛血清白蛋白（BSA）溶液：將PA的NaOH溶液趁熱加入28.5 mL 5%BSA溶液，1:20稀釋，並迅速放入 60 °C水浴以防止析出；（3）配置含PA的培養基：將PA的BSA溶液加入120 mL不含血清的DF12培養基中，以1:5的比例稀釋。

PA 和高糖複合模型培養基：在 PA 培養基的基礎上補充糖量至8 mg/mL。

1.3.2 形態學觀察及線粒體染色 取對數生長期細胞，10⁵的密度點6孔板，用含血清的正常培養基培養細胞，待細胞長到80%後棄去培養基，換為無血清培養基飢餓24 h後，換成造模溶液，37 °C含5% CO₂環境培養。12 h、24 h以後棄去培養基，加入1 mL的Hank"s溶液輕微盪洗兩次，然後將Mito-Tracker Green按1:1 000-1:50 000比例加入Hank"s溶液作為工作液，每孔加入1 mL工作液。37 °C溫孵箱溫孵30~45 min後，棄去工作液，加入預先由37 °C溫孵過的Hank"s溶液後在顯微鏡下觀察。

觀察分為明場和熒光兩次，且必須保證兩次觀察視野固定。

1.3.3 細胞代謝組學測定 取對數生長期細胞，以10⁵的密度點6孔板，用含血清的正常培養基培養，待細胞長到80%後棄去培養基，換為無血清培養基飢餓。24 h後換成含造模溶液的培養基，分別培養12 h、24 h後棄去培養基，將6孔板置於-20 °C保存。需要測定時取出細胞板，每孔加入300 μL超純水，凍融3次。最後將已融化的細胞液輕輕刮下，放置於1.5 mL EP管中。 取20 μL於另一個1.5 mL EP管中用來定蛋白，剩餘的280 μL細胞液加入840 μL的甲醇（3倍體積，含內標同位素肉蔻酸），於渦旋振蕩器上震蕩5 min，4 °C冰箱靜置1 h，20 000 g高速離心10 min。取400 μL上清於GC小瓶中，45 °C真空揮干3 h，向幹了的小瓶中加入30 μL的甲氧胺吡啶（現配現用，10 μg/mL），渦旋3 min後，常溫靜置肟化16 h。在樣品中再加入30 μL的MSTFA（1%TMCS作為催化劑），渦旋3 min，衍生化（三甲基硅烷化）反應1 h， 最後向小瓶中加入30 μL甲基肉蔻酸（15 μg/mL），震蕩1 min後靜置待測。

1.3.4 qPCR法檢測細胞內相關酶的表達 細胞培養方式同「1.3.3」。用PBS溶液洗滌兩次後加入RNAiso溶液吹打細胞直至完全。吸取含細胞的裂解液至EP管中，加入20%的氯仿，上下顛倒20次，充分乳化後室溫靜置5 min。4 °C ，12 000 g離心15 min， 吸取450 μL上清液加入等量的異丙醇，上下顛倒20次，常溫靜置10 min。4 °C ，12 000 g離心10 min，傾倒上層異丙醇溶液，保留白色沉澱。加入1 mL 75%的乙醇（DEPC水配置）清洗沉澱。4 °C，12 000 g 離心5 min後加入10 μL DEPC水溶解沉澱。逆轉錄成為cDNA，並進行擴增反應，最後通過目標基因和參照基因的Ct值計算出目標基因的相對表達量。

1.3.5 數據處理實驗結果由SPSS18.0進行分析。代謝組學數據首先運用相似度搜尋方式對比未知化合物質譜圖和已知庫內的質譜圖（NIST08, Wiley），對色譜中各個時間化合物進行鑒定，鑒定後根據各個化合物的質荷比對各個化合物峰進行積分。得到的積分數據運用內標外標矯正，再運用蛋白量矯正。所得積分數值通過Simca-P13.0進行分析，並用metabo-analysis網路工具進行分析。組間方差齊性採用t檢驗。

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結 果

2.1 造模後腎小管上皮細胞的影響熒光顯微鏡下觀察到對照組細胞狀態正常，沒有出現受損狀況，細胞邊界清晰，線粒體染色後觀察到細胞亞細胞器完整結構正常且邊界清晰。高糖組細胞輕微受損，線粒體染色後發現，正常狀態的細胞數量較正常組有所減少。PA組細胞損傷現象非常明顯，明場下觀察到貼壁細胞數量明顯減少，細胞邊緣模糊，染色後發現細胞受損嚴重，線粒體損傷。PA複合高糖組，細胞損傷亦十分明顯，染色後發現對照組細胞的數量較PA組更少，細胞邊緣模糊且細胞形態發生改變，線粒體結構出現明顯的損壞。見Fig.1。

2.2 PA對腎小管上皮細胞的代謝擾動運用已建立的氣相代謝組學方法進行代謝組測定（典型色譜圖見Fig.2，鑒定出69種已知化合物）。分析發現在12 h和24 h，對照組樣本點距離較近，說明對照組代謝一直保持正常水平，高糖組樣本點距離對照組不遠，表明高糖誘導的細胞並未出現明顯的代謝差異；而PA組後樣本點與對照組距離較遠，表明PA誘導的細胞後出現明顯的代謝差異，複合因素誘導差異更大，見Fig.3。代謝組學分析表明在12 h和24 h PA組細胞都較對照組出現了明顯的代謝差異，見Fig.4。

2.3 代謝通路異常與差異化合物詳細分析各組間差異化合物，發現三羧酸（TCA）循環、氨基酸、部分脂質代謝通路出現代謝差異。其中TCA循環的差異占代謝差異的主要部分，表現為TCA循環出現在代謝通路圖（Fig.5）的右上角且在代謝通路分析棒圖（Fig.5）的上半側。提示TCA循環紊亂可能是PA誘導的腎臟細胞出現代謝異常的主要原因。於是我們對TCA循環中間物質進行代謝組學半定量分析，發現12 h時高糖組琥珀酸峰面積明顯增加（P<0.05），而PA組時琥珀酸峰面積顯著增加（P<0.01），複合因素組的影響較PA組更為明顯（P<0.01）；在24 h時高糖組琥珀酸水平明顯降低（P<0.05），而PA組和複合因素組誘導出現了顯著的降低趨勢（P<0.01），見Fig.6。同時我們發現12 h高糖條件下並不能誘導檸檬酸峰面積增加，而PA可以誘導檸檬酸顯著增加（P<0.01），複合因素誘導下的檸檬酸增加現象更為明顯（P<0.01）；在24 h時，PA和複合因素誘導下檸檬酸水平均顯著下降（P<0.01）。

2.4 造模細胞檸檬酸琥珀酸定量分析基於半定量結果，我們運用相關標準品對檸檬酸和琥珀酸進行了精確的定量。定量結果顯示高糖並不能誘導琥珀酸及檸檬酸水平的積聚，而PA在12 h可以造成琥珀酸水平升高（P<0.05）和檸檬酸水平升高（P<0.01）。12 h時複合因素誘導也可以導致琥珀酸水平顯著升高（P<0.01）和檸檬酸水平顯著升高（P<0.01）。而24 h時PA誘導的HK-2細胞內琥珀酸和檸檬酸出現顯著下降（P<0.01）。見Fig.7。

2.5 TCA循環相關酶表達測定我們測定了模型細胞中丙酮酸脫氫酶（PDHA）和谷氨酸脫氫酶（GLUD）的表達，發現在PA和複合因素誘導下，12、24 h PDHA及GLUD（P<0.05）的表達均上調，見Fig.8。

琥珀酸上游合成酶succinate-CoA ligase的三種亞型中，高糖上調SUCLG1（P<0.05）而對其他兩種亞型的上調不明顯。而PA尤其是複合因素誘導下，在12 h可以明顯上調琥珀酸上游合成酶的表達（P<0.05,P<0.01）。在24 h，琥珀酸上游合成酶表達出現明顯下調（P<0.05,P<0.01）。而在高糖、PA以及複合因素誘導下琥珀酸下游分解酶琥珀酸脫氫酶（SDH）的表達均無明顯變化，見Fig 9。

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討 論

DN作為糖尿病的主要併發症之一，一旦發現極難治療，且預後極差。早期研究表明DN的病變起始於腎小球損傷，但近期研究發現腎小管細胞損傷作為糖尿病腎病的病因，其優先程度逐漸增加，甚至超過腎小球損傷，同時也是糖尿病患者後期出現終末期腎病（ERSD）的重要原因，所以腎小管損傷也逐漸成為了治療糖尿病腎病的研究切入點^[24-26]。

在前期實驗中，我們發現DN模型小鼠血液和尿液中棕櫚酸水平升高，同時文獻表明棕櫚酸作為一種重要的脂肪酸，常被用於DN及胰島素抵抗模型^[22-23]。所以我們採用高糖與棕櫚酸誘導腎小管上皮細胞（HK-2）模擬體外DN環境，探究DN狀態下的代謝差異以及可能的機制。

DN狀態下的腎臟細胞處於高糖環境，故高糖培養基常被運用於建立DN細胞模型^[27]。本實驗發現高糖單因素誘導腎臟細胞損傷在短時間內效果不明顯，而棕櫚酸誘導腎細胞在短期內就出現了明顯的損傷，棕櫚酸誘導的腎細胞在附加高糖的情況下造成的損傷與棕櫚酸類似。說明腎臟模型細胞在短期內出現的損傷可能主要源自於棕櫚酸而非高糖。

代謝組學作為一個新興的「組學」科學中的一員，可以對大量內源性化合物同時測定，越來越廣泛的運用於生命科學研究、代謝性疾病研究及臨床生物標註物找尋^[28-30]。我們應用前期建立的基於GC-MS的代謝組學方法對棕櫚酸誘導的DN細胞進行研究，實驗發現，高糖誘導的腎臟細胞出現輕微代謝差異，棕櫚酸誘導與複合因素誘導情況下出現更加明顯的代謝差異，提示在短時間內高糖誘導後的腎臟細胞無法出現明顯的代謝紊亂，而棕櫚酸在短期就可以誘導腎臟細胞出現代謝差異。對棕櫚酸誘導情況下的代謝差異化合物進行分析，發現三羧酸循環、氨基酸代謝及部分脂肪酸代謝通路均出現紊亂，這與部分報道相符。其中TCA循環代謝異常最為明顯。半定量結果顯示琥珀酸和檸檬酸水平都表現為早期升高，而隨時間的增加復又降低。此現象又經定量方法證實。提示TCA循環代謝紊亂可能與DN有著較為緊密的聯繫。

TCA循環的代謝紊亂在很多疾病中也會出現，但是原因大多不一樣^[31-33]。TCA循環中的NAD+、琥珀酸、檸檬酸都被證實可以影響機體免疫^[34-39]。前期研究中，我們也發現在DN小鼠體內出現早期的檸檬酸和琥珀酸等TCA中間產物蓄積現象。提示TCA循環紊亂可能與DN的發生髮展過程密切相關，並可能通過造成炎症和影響機體免疫加重病情^[40]。本實驗結果表明，一般情況下琥珀酸水平是由琥珀酸上游合成酶和下游分解酶決定。本實驗結果表明，高棕櫚酸誘導的腎臟細胞出現的琥珀酸升高可能是由於琥珀酸合成酶succinate-CoA ligase上調而分解酶SDH的不明顯變化導致，且琥珀酸上游合成酶的表達趨勢為先上升後下降及琥珀酸分解酶無明顯變化，這些與琥珀酸物質水平變化基本一致。且在生理情況下，TCA循環中間產物是由丙酮酸在丙酮酸脫氫酶（PDHA）催化下轉化為的乙醯輔酶A和谷氨酸在谷氨酸脫氫酶（GLUD）催化下轉化為的α-酮戊二酸經轉化提供^[41-42]。在棕櫚酸誘導的腎臟細胞中PDHA和GLUD上調，可能造成TCA循環中間產物增多。

綜上所述，TCA循環尤其是其中的琥珀酸可能與DN有密切的關係，可能對DN的防治有重要意義，其他的機制有待於進一步研究。

參考文獻略

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