藥物設計：靶向蛋白質相互作用

靶向蛋白-蛋白相互作用長期以來被認為是一項非常困難的任務，但在過去十年中成功案例的數量增長非常迅速。考慮到小分子方法的優勢和缺點，以及人造抗體，肽或肽擬似物的選擇或設計等替代策略，本文概述了該領域近期進展。

蛋白-蛋白相互作用

隨著FDA批准的新葯數量減少，醫藥研發也經歷著生產力的下降。市場力量、需求與競爭使得醫藥研發越來越具有挑戰性。對疾病機制理解的進步表明，可以剖析複雜和多因素系統，以確定可靠、安全和有效的藥物。

疾病的起源往往在生物相互作用的複雜網路中，不僅需要在臨床水平上，還要在表型和分子水平上進行理解。從這個角度來看，已經開發了廣泛的「組學」方法，希望正在積累的數據，可以用於個性化治療。其中，蛋白質組學方法導致在不同模型物種和幾種人類細胞系中建立蛋白-蛋白相互作用（Protein-Protein Interaction：PPI）網路。

PPI網路是高度互聯的，一些蛋白質表現為中樞，並且涉及大量的相互作用。中樞蛋白的典型實例是網路中顯示為中心節點的人蛋白質p53，發現在多種類型的癌症中突變。導致抑制蛋白功能的突變可能影響PPI網路，仍然很難預測突變對PPI網路的影響有多遠。預測各種細胞類型或組織中表型的突變後果仍然沒有達到。

破譯與PPI網路相關的分子合理性仍然是未來十年基礎研究和藥物研發的重大挑戰。幾十年來，藥物研發已經產生能夠抑制與疾病相關的許多蛋白質靶標的活性分子，或者靶向於複雜細胞途徑的G-蛋白偶聯受體（GPCR）。這樣的分子可以用作干擾PPI網路的工具，並評估相關的細胞反應。歷史上，製藥公司將精力集中在靶向位於細胞表面或細胞內酶的GPCR上，因為這些靶標存在圍繞其活性位點的空腔。然而，這些靶標通常在PPI網路中佔據中心位置，其活動通常會影響與其相關的通路。

設計蛋白-蛋白相互作用的特異性抑制劑可以代替PPI網路中高度互聯節點的多效抑制劑。這些抑制劑不僅有助於解開互連網路的複雜性，而且可以提供更廣泛的藥物靶標。

小分子調節劑

發現與細胞內蛋白質夥伴競爭結合的小分子是一項艱巨的任務。設計抑制PPI的小分子的一個難點與應該被分子覆蓋的表面的大小有關，而抑制酶的活性位點一般通過佔據酶的功能腔來實現。與酶的活性位點或受體的結合位點相比，PPI通過由蛋白質原子埋藏形成的大界面穩定，達到數千平方埃。除了與表面尺寸競爭的難度之外，PPI界面還代表著多樣化和多方面的結合位點，在構建有效的抑制劑方面構成重大挑戰。

尋找小分子PPI抑制劑的第二個難題在於缺乏用於篩選靶向激動劑或拮抗劑的簡單功能測定技術。在PPI的情況下，必須重新審視高通量篩選（HTS）。已經開發出測量使用反向兩種雜交或BRET的相互作用喪失的高通量蜂窩篩選，並且提供僅選擇細胞可穿透分子的優點。

由於八十年代蛋白質結合界面能量分析的出現，小分子PPI抑制劑得到了持續有力的發展。通過丙氨酸掃描技術探索在發生結合時不同接觸的貢獻。這種技術表明，界面殘基的一些突變對兩個分子的結合親和力幾乎沒有影響，另一些突變主要是不穩定效應。在熱點位置相互作用的小分子應與同源伴侶的結合形成競爭，而不必覆蓋整個相互作用的表面。

作為小分子PPI抑制劑開發的積極步伐，熱點位置與蛋白質多重結合位點的位置相關。定義這些位點為蛋白質同源家族表面的殘基，它們對應於穩定天然蛋白質協助夥伴的相互作用中起著關鍵作用的蛋白質的「粘性區」，並且易於結合小分子。最新的研究顯示這些粘性區域富集了抑制劑結合能，為合理選擇結合分子開拓了新的思路。

在較大的蛋白蛋白界面中，熱點可以在界面上分布得更多，其間距相當大。它們涵蓋了更複雜的化學功能組合，增加了發現所有熱點抑制劑的難度。PPI抑制劑顯示出比傳統藥物更大的尺寸和分子量。PPI抑制劑也更具疏水性，它們含有更多數量的氫鍵和至少四個環。這種與經典特徵的偏離指出了組合專用於PPI篩選的分子庫的必要性，其含有比傳統藥物設計的化合物庫更高的化學多樣性和更大的複雜性。對天然產物的進一步探索通常應該有助於多樣化和補充這類化合物。用於搜索PPI抑制劑的計算工具也與實驗篩選相結合，以加速篩選和降低成本。

化合物庫組合的另一種方法稱作 「片段方法」。它不是選擇分子量相對較高的起始分子，而是對一個夥伴進行一組簡單的低親和力小分子片段搜索，並通過基於結構的策略逐步建立抑制劑。對於該策略，結合熱點的確定對於定義分子可以有效結合與同源夥伴競爭的關鍵位置特別有用。在前期的篩選中採用X射線或NMR技術直接進行基於結構的篩選取得成功。可以基於其結合位點直接選擇起始分子。即使起始化合物的親合力落在毫摩爾範圍內，通過擴大分子大小同時優化結合親和力來優化已經足夠。也可以使用晶體接觸來找到新的結合位點，並通過連接片段增加分子的大小。選擇第一個片段的另一個成功的策略是通過SS鍵在接近靶向PPI相互作用的位置上束縛分子。在該策略中，靶標和初始片段化合物之間共價鍵的存在有助於獲得複合物的結構。

蛋白調節劑

當靶標相互作用包括大的PPI作用界面時，需要尋找小分子方法的替代方案。第一類開發策略是與PPI形成競爭的單克隆抗體。這種使用人源化免疫球蛋白以防止免疫反應的方法非常成功，因此每年有數十種新抗體開始進行臨床試驗或獲得FDA批准用於治療或診斷。

在這一領域計算方法也做出了重大貢獻。建模和設計工具，如Rosetta已經達到了足夠的準確性以便能夠指導結合劑的合理設計。將合理的設計策略與最先進的顯示技術相結合，為結合劑類的多樣化打開了很大的視角。計算方法也可用於設計降低蛋白的免疫原性。

設計用於抑制PPI的天然、工程或人造抗體通常被認為與同源夥伴競爭；但在少數情況下，他們也通過變構機制發揮效應。然而，由於蛋白質構象的微妙變化，後一種效應機制難以合理化或預測。

最後，選擇用於緊密結合靶標的抗體、納米抗體和其他蛋白質的主要限制仍然是這些蛋白質進入細胞的困難。它們的應用主要限於細胞外靶標。

肽和肽擬似物

肽是足夠大的天然化合物，可能阻礙PPI相互作用和命中幾個熱點。然而，靶向細胞內PPI時，肽抑制劑必須跨過細胞膜。目前細胞穿透肽（CPPs）方面取得了重大進展，這為細胞內肽樣藥物的發展帶來了顯著進步。特定肽序列穿透細胞的能力首先在神經遞質和病毒蛋白的小蛋白中發現。然後深入研究滲透機制，突出顯示各種機制，具體取決於仍在研究中的CPP類型。進入細胞涉及內吞吸收，但也可直接穿越膜。通過在N或C末端添加CPP序列或通過在不干擾靶標結合的位置修飾肽的帶正電荷的殘基，將CPP性質轉移到活性抑制肽。滲透序列是變化和優化的，並且引入化學修飾。

關於肽策略的一個重點是，通過已經開發用於蛋白質或抗體的方法，即分子生物學，定向進化，計算設計工具等，可以改進肽對靶標的親和力。後一種計算方法需要具體考慮到與球狀蛋白相比肽增加的柔性。肽策略的另一個優點是從中受益的簡單合成步驟幾十年的固相化學合成開發。因此，可以容易地建立用於檢測第一肽命中的高通量方法，例如肽陣列或對同源靶標的肽選擇性的研究。

肽作為藥物的主要限制仍然是它們對體內蛋白酶的高度敏感性，即使快速內化顯示出部分保護。為了克服肽類藥物相關的這種障礙，文獻中已經提出了大量的化學修飾增加與天然肽支架的偏差，PPI抑制有一些顯著的成功。進行非天然側鏈的引入以通過優化靶標接觸同時增加溶解度或限制蛋白水解來增加親和力。可以在有限的肽構象擾動的某些位置引入D-氨基酸。肽環化還通過設計簡單的環肽或引入結合劑進行。螺旋釘不僅顯示出穩定的螺旋構象，而且有利於細胞穿透和保護肽免於蛋白水解。與天然肽更為不同的是，非α-氨基酸骨架的低聚物被設計成保持其形成定義良好的結構的能力。可以設計這些所謂的摺疊物，以保持錨定殘基與蛋白質靶標相互作用的位置，同時具有超過100倍的蛋白水解抗性。有趣的是，摺疊劑的合成在一些情況下可以採用固相合成，促進其生產和純化。此外，目前為了摺疊體的合理設計開發了計算工具，所有這些努力都應該為抑制任何PPI靶標鋪平道路，而不限制與界面競爭的尺寸和組成。

總結

抑制蛋白質相互作用已經具有大量實例，並且可以設想為更一般的策略來破譯與PPI網路相關的分子邏輯，或用於治療應用。根據靶標界面的大小，交互的親和力和熱點的位置，可以設想不同的策略。小分子更適用於小型和緊湊的界面，而通過使用肽模擬物更可能實現對大界面的抑制。抗體被認為是靶向細胞外受體的首選方法。在一些實例中，肽用作第一分子以驗證目標並促進搜索活性肽擬似物或小分子。

考慮到尋找PPI抑制劑，需要擴大化學空間以有效篩選小分子，並且應該優先聚集專門的化合物庫，也可以選擇核酸適配子結合蛋白質表面並抑制蛋白質相互作用。設計廣泛的肽模擬物的開發工作仍在進行中，應增加有助於靶向PPI的分子化學空間，這種分子的主要障礙可能是免疫反應。最後，如果幹擾PPI的研究不斷取得進展，那麼能夠恢復由致病突變引起的PPI損失的分子仍然限於特殊情況。這種分子在開發遺傳性疾病中的新藥物將是非常有意義的，這可能是該領域即將到來的重要挑戰。

END

參考資料：1）Bakail M, Ochsenbein F. Targeting protein–protein interactions, a wide open field for drug design[J]. Comptes Rendus Chimie, 2016, 19(1): 19-27.

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