CRISPR/Cas9 三大新工具讓基因編輯不再高冷

與它的前任不同，CRISPR/Cas9系統讓基因組編輯技術變得簡單易行，又經濟實惠。因此，原本高冷的基因組編輯技術迅速普及，進入更多的實驗室。近年來，新的工具和產品不斷湧現，為實驗的每一環節提供了簡便的方法。現在，我們就來盤點一下，CRISPR/Cas9領域有哪些新工具。

表達系統

在CRISPR/Cas9系統中，我們需要表達的是兩個關鍵組分：Cas9核酸酶和嚮導RNA（gRNA）。如今，儘管可供選擇的表達系統在不斷增加，但具體選擇哪個，要取決於你的具體應用。大家可參考《新手指南：如何規劃我的CRISPR實驗》。

CRISPR質粒是大家比較青睞的方法。許多公司目前提供all-in-one的表達載體，包括Cas9核酸酶表達框以及gRNA克隆框，能夠快速高效地表達Cas9和gRNA。這些載體往往還帶有報告基因或選擇標記，以便富集陽性細胞。

賽默飛世爾就提供了兩種GeneArt CRISPR Nuclease Vector，一種帶有橙色熒光蛋白（OFP），可通過流式細胞儀分選表達gRNA的細胞；另一種則帶有CD4報告基團，便於通過Dynabeads CD4磁珠富集陽性細胞。

Takara旗下的Clontech也提供了各種質粒載體系統，包括Guide-it? CRISPR/Cas9 System。這種單質粒系統實現了Cas9與綠色/紅色熒光蛋白（ZsGreen1或tdTomato）標記的同時表達，便於監測轉染效率，讓細胞富集/分選變得更簡單。若細胞難以轉染，則可以考慮重組腺相關病毒介導的基因編輯系統。

AAVpro? CRISPR/Cas9 Helper Free System是一個一體化系統，包括了製備AAV病毒所需的全部組分。AAV的不整合特性避免了Cas9的持續表達，減少了細胞毒性和脫靶效應，也適合體內應用。

對於轉染效率低的細胞，Clontech還推出了一個新的解決方案，那就是藉助細胞來源的納米囊泡（Gesicle）。Gesicle表面附有具有細胞膜親和特性的NIGP蛋白質，使其可以與廣泛的細胞類型相融合。你只要將Cas9和gRNA包被其中，就可以高效導入。Gesicle表面同樣也附有CherryPicker紅色熒光蛋白，便於通過熒光顯微鏡進行監測。

CRISPR系統的脫靶效應也是讓人關心/擔心的。若希望盡量減少脫靶切割，可以考慮Invitrogen? GeneArt Platinum Cas9 Nuclease。這是一種野生型的Cas9蛋白，它與gRNA形成非常穩定的核糖核蛋白（RNP）複合物，能夠實現高效的切割。這種複合物在進入細胞後立即發揮作用，而不需要轉錄和翻譯，帶來立竿見影的效果。同時，它會被細胞迅速清除，與載體相比造成脫靶切割的機會降低。Cas9 RNP複合物可以通過賽默飛專利的Lipofectamine CRISPRMAX轉染試劑導入細胞，也可通過顯微注射。

設計gRNA

關於gRNA的設計，許多網站都提供了設計工具，而許多科學家也貢獻了寶貴經驗。在不同的CRISPR實驗中，設計gRNA時的考慮因素也不同。對於插入缺失的應用，gRNA靶定的位置並不重要，但必須活性高，脫靶效應低。對於基因表達的激活或抑制，位置和序列都必須考慮。而對於基因編輯（如HDR），位置是重要的考慮因素，因為靶定位置必須在編輯區域附近，這也意味著沒有太多gRNA可供選擇。

（圖片來自Addgene）

在挑選了若干條gRNA之後，如果你需要製備gRNA。NEB有一個十分受歡迎的工具 – EnGen sgRNA Synthesis Kit，可在一小時內產生和純化5-20 μg gRNA。你只需要一條短短的單鏈DNA oligo就行了，無需PCR、無需克隆，也不需要等待RNA oligo的化學合成。它將試劑盒自帶的Cas9特異的Scaffold Oligo與你的DNA oligo退火，然後用DNA聚合酶延伸，形成雙鏈DNA模板並轉錄，從而產生功能性的gRNA。

Addgene這個質粒共享的非營利組織，也提供了2000多種經過驗證的gRNA，是全球科學家在實驗中使用過的。此外，Addgene也提供全基因組水平的gRNA文庫，以及適合各種實驗的空骨架，以便研究人員能克隆特定基因的gRNA。據介紹，最受歡迎的質粒是空的gRNA載體PX458和PX459，它們來自張鋒實驗室，包含SpCas9和選擇標記EGFP或PuroR。

確認結果

在一系列克隆、轉染、表達的工作完成後，最緊張的時刻來了，你需要確認基因編輯的效果。《新手指南：如何規劃我的CRISPR實驗》這裡介紹了一些方法。市場上也有一些成熟的產品，可簡化你的工作。

Clontech的Guide-it?系列就包括多個產品，可檢測基因編輯的效率、確認細胞基因型，以及鑒定突變位點的序列。Guide-it? Mutation Detection Kit利用錯配裂解法快速檢出細胞基因組中導入的插入缺失突變。它無需提取DNA，可直接以細胞為起點進行PCR擴增。將PCR產物變性和退火之後，Guide-it?解離酶對不完全匹配的DNA進行剪切。之後跑膠，可根據片段大小確認編輯效果。

有時，你是不是也有這樣的困擾，花了大量的時間和成本，卻很難篩選到雙等位基因突變型克隆。Guide-it? Genotype Confirmation Kit此時可以幫你解憂。它通過Cas9和gRNA體外剪切，可方便地確認單等位基因和雙等位基因突變。在目的片段擴增後，Cas9和gRNA剪切野生型、單等位基因突變和雙等位基因突變的片段，可以產生不同大小的片段，從而輕鬆地區分。

如今，有了這些新工具，CRISPR/Cas9基因編輯可謂觸手可及。不過，基因編輯技術日新月異，稍不留神，就會錯過最新進展。希望緊跟技術潮流，那就趕緊關注生物通吧。（生物通余亮）

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