連續灌注細胞培養秘笈淺談

最新 07-20

1、引言

過去的幾十年里，生物製藥行業在細胞培養fed-batch（補料分批培養）實現高表達方面取得了巨大的進步，形成了一整套完整的工藝開發和生產體系，其因操作相對簡單，易於監控和產品檢測和放行等特點，絕大多數企業均採用fed-batch作為其藥品生產的操作方式。

然而，現在一些公司開始開發連續流工藝培養模式，因為相對於傳統的批次和補料批次培養方式，連續灌注培養生產能用更小的設備表達更多的產物，同時還能有效改善產品質量。而且該培養模式中，補料營養成分連續加入，有害代謝產物會及時去除，從而使得細胞在長時間內維持高密度培養和活率。這樣不僅讓細胞處於平衡穩定狀態，表達的產物具備高度一致性，尤其是敏感和不穩定的分子而言，及時持續的從罐體從收穫純化蛋白能最大程度的保證產品的穩定性。所以，當反應體系內表達的是易降解或者半衰期很短的產品時，灌注的優勢尤為明顯。同時，培養環境的優化、體系的精確穩定控制、細胞培養基的開發以及微膜過濾細胞截留設備的發展也進一步推動了連續灌注工藝的發展。

已經有多個使用灌流工藝進行培養的上市產品，如凝血因子（FVIII產品： Kogenate，拜耳； Refacto，輝瑞；FVII產品：Novoseven，諾和諾德）；Protein C（Xigris，禮萊）以及其他的酶製劑甚至包括一些單抗產品（Reopro和Remicade，強生； Simulect，諾華）。

2、連續灌注培養方式

目前，連續灌注培養方式主要有兩種，根據其在截留設備中的流體流動方向分為切向流過濾（Tangential flow filtration，TFF）和交替切向流過濾（Alternative tangential filtration，ATF）。TFF中，細胞液通過泵的蠕動作用形成一個連續的環形流動方向，進入纖維膜後，廢液會通過膜排出體系之外，細胞會隨著環路重新回到培養體系之內。ATF是目前採用更多的一種方式，其通過隔膜泵的往複吹吸作用，實現罐體內培養液在截留設備中的迴路流動，而液體中的代謝廢物，如乳酸、銨和一些代謝氨基酸，會通過膜排除體系之外，細胞重新回到罐體。另一方面，新鮮培養基會等量持續加入形成平衡，如表1和圖1所示。

表1 ATF和TFF對比

圖1 TFF和ATF的結構示意圖

3、濃縮分批補料和連續灌注生產

連續灌注培養分為濃縮分批補料和灌注培養兩種方式，其主要區別在於截留設備分子量的大小和目的產物的不同，其對比如表2所示。濃縮分批補料的主要目的是在相對短的時間內，通過高細胞密度和活率的維持實現高表達，通常用於表達單克隆單抗這些穩定蛋白的產品，它們不會隨著培養時間的增加（20-30天）而出現降解等產品質量方面的問題。對於灌注生產而言，目標蛋白會持續通過截留設備流出到反應體系之外，因此可以保證蛋白持續收穫純化，從而形成不同的「亞批次」，通常用於表達不穩定的融合蛋白和細胞因子這些產品。如表2和圖2所示。

表2 濃縮分批補料和連續灌注培養

圖2 濃縮分批補料和連續灌注培養

4、連續灌注培養關鍵點

不同於傳統的fed-batch培養定量加入濃縮補料，連續灌注培養需要精確的反應體系控制，使之達到相對平衡的狀態，因此在實際工藝開發過程中，有諸多關鍵點需要解決，如表3。

表3 連續灌注培養關鍵點

從工藝角度看，30-60天（甚至更多）的培養需要更穩定的細胞株，因此在早期克隆篩選中就需要考察細胞株的穩定性（生長、表達、基因拷貝數，以及產品質量等方面），而不是在建立相應細胞庫之後再做考察，否則會因為細胞株自身的不穩定造成質量的一致性問題。連續灌注培養要求新鮮培養基的持續加入，因此培養基配製和儲存中的穩定性尤為重要，因為其會直接影響到營養物質濃度的成分是否一致穩定。從另一個角度，由於新鮮培養基的加入量通常為1-2vvd（每天加入的培養基體積），培養結束可高達30-120個體積，所以培養基成分的優化必將能極大的縮減成本。同時補料、去除和過濾速率均會影響到反應體系內的營養物質是否處於相對平衡狀態。另外，如何在設備極限傳質和混合條件下實現高密度細胞的連續穩定培養液非常重要，實際工藝開發中需要摸索和調整目標與控制條件的平衡。類似傳統的fed-batch培養，工藝參數的優化也必不可少，其會影響到細胞活率的長期維持狀態和蛋白質量的一致性，例如降低溫度以維持活率以降低高密度狀態下對營養成分的過度消耗。

從對培養環境的硬體要求來看，反應器需要在長時間的培養中維持極高的精確度和穩定性，通氣盤的設計要能滿足細胞高氧傳質係數的要求，又能及時的去除大量累積的CO2。目前，sparger（通氣盤）的設計主要分為macrosparger（大泡鼓泡通氣）和microsparger（微泡鼓泡通氣），或者通氣盤將兩者結合。Macrosparger的孔徑一般為0.5-1.0mm，microsparger的孔徑一般為10-20um和200-250um兩種，macrosparger由於產生的氣泡直徑較大，比表面積更小，所以KLa（傳質係數）相對較低，雖然提高通氣量可以一定程度上提高KLa，但是效果有限，而且會對尾氣出氣造成潛在威脅，因此macrosparger孔徑以及孔的分布非常重要，它直徑影響到細胞代謝產生的CO2能否及時的從液體進入氣泡而隨著上升帶出反應體系，而不造成過高pCO2（CO2分壓）。從O2的傳質來看，較小孔徑的microsparger能達到相對較高的KLa（>25h-1），但是過小的氣泡在上升過程中會裹挾大量細胞，當達到頂層氣液表面後爆炸，此時產生的衝擊力將極大降低細胞活率。因此，並不是產生氣泡越小的microsparger越有利，雖然它能改善因高密度細胞帶來的傳質需求，但我們得同時考慮到其表面氣速過高時對細胞的損傷。同樣，無論macrosparger還是microsparger，它們的傳質效果與攪拌也關係密切。傳統細胞培養工藝認為，哺乳動物細胞耐受攪拌剪切力的能力有限，通常使用三葉斜葉作為首選，但是隨著人們對細胞尤其是CHO（中國倉鼠卵巢細胞）的深入研究和馴化，現在一些細胞已經能忍受相對較高的剪切力，所以一些情況下可考慮加入一個用於微生物培養的6葉槳，增加混合效果的同時也能提高傳質效果，從另一個角度看，也能降低反應體系通氣量的需求。細胞在相對高密度時比其低密度時對同樣轉速的剪切力耐受力更強，所以這不失為一個選擇的方案。

高密度下大量鼓泡氣體的進入勢必會對培養體系的尾氣提出更高的挑戰，尤其是對於一次性反應器而言，培養袋的耐壓能力和尾氣高通量非常重要，加配備用尾氣加熱和冷凝迴流裝置將有效避免尾氣堵塞的風險。大規模培養時，使尾氣在進入濾器之前充分加熱氣化然後進入，這樣能避免因為氣體中夾帶的液體堵塞尾氣疏水性濾器，配置備份加熱套和濾器也應考慮在內。同樣，反應器的攪拌混合和方式與整體氣體策略，以及尾氣出氣效率息息相關，能在保證低剪切力的前提下，最大程度的提高混合和傳質效果，能減少因高密度培養袋來的極高通氣需求，進一步降低對尾氣壓力的挑戰。因此，從這個層面上來看，細胞的培養環境在實際連續灌注培養中需要重點關注。

從系統控制角度來看，精確的反饋信號控制同樣不可忽視。目前，大多數在小試階段採用的仍然是定量補料和定量收穫，從而保持反應體系的穩定。由於玻璃罐體規模較小，這種相對粗放的方式容易控制，所以仍是可接受的一種方案。但是對於更大規模，比如百升甚至千升以上的反應器而言，這樣簡單的控制就顯得力不從心，做到絕對的等量補料和去除體積受到各種因素影響，因此精確而及時的反饋控制非常有必要。以反應器的重量或者補料重量作為控制補料和去除體積的重量反饋控制指標，可以有效控制反應的穩定性，使其處於相對平衡的狀態，降低了因其他不可控因素造成的補料和收穫量的不一致進而引發的安全性問題。其控制方案如下所示。所以，從工藝開發放大的角度看，及時簡單的工藝手段能夠完成小試階段開發的需求，但是仍需要掌握更精準的反饋控制以提高放大的成功率。

圖3 連續灌注反應器控制方式

Fed-batch中經常使用葡萄糖濃度作為工藝開發中補料加入的基準參數，除了氨基酸、脂類和維生素等，葡萄糖對細胞生長和表達有著非比尋常的作用，它既是細胞能量代謝的來源，其代謝中間體也是糖基化作用的重要底物，所以葡萄糖濃度的平衡控制對最終產物質量十分重要。從另一個角度看，如以葡萄糖濃度作為補料速率的indicator（指針），那必定將極大提高補料量的有效性，避免實際情況中因擔心營養成分不夠而造成的過量補料，實現精準控制，降低培養基的成本。另外，細胞達到PVCD（Peak viable cell density，最高活細胞密度）之後，設備的穩定運行面臨著極大的挑戰，如何使細胞維持較高的密度，又能保持相對可以接受的活率是工藝開發中需要解決的問題。如數據記錄軟體能實時收集運行系統中的活細胞量，而不是傳統的離線取樣計數，那麼據此可構建補料或者去除細胞液的控制迴路，將過量細胞及時從系統排除，同時維持設備極限下所能維持的最高密度，必將發揮灌注培養的最大優勢。

從數據的收集和控制來看，長時間的培養必然會產生大量的數據，如果只是簡單的跟蹤幾個常見工藝控制數據，可能會導致對培養工藝理解的偏差。因此，全面、準確而及時的實時捕獲培養過程中的所有數據十分重要。工藝優化是一個持續改善的過程，我們需要對每個批次培養中的數據做一個全面分析，採用MVDA（Multivariate analysis，多變數分析）的方法找出各數據之間的深層次邏輯聯繫和其對目標的影響，然後結合DoE（Design of experiment，實驗設計）的方法尋求穩定可操作空間，使培養體系真實、穩定、可靠。除此之外，對於批次運行後的數據處理同樣不可忽視，傳統方法將表達量或質量等結果與某一因素單一對應進行考察，但實際情況往往比這要更複雜，一個結果的出現由多種因素共同作用，所以需要對批次後數據進行MVDA，找出多個變數如何影響最終結果，據此作出判斷優化工藝生產。

截留設備與反應系統的連接方式有很多種，對於玻璃罐而言，常見使用從頂蓋的diptube深入發酵液，與ATF或TFF構成迴路，對於不鏽鋼或者一次性反應器而言，包括T/C卡盤、無菌快接頭、OPTA無菌接頭以及無菌焊接等。根據截留設備大小的不同，選擇相應尺寸，同時細胞在管路中受到的剪切力以及連接處的壓力承受能力都需要注意，有時會加上多個管路迴路或者截留設備以降低細胞受到的剪切力和提高截留能力。

5、總結

連續連培養作為一種新型技術極大的拓展了人們對工藝生產方式的理解，它解決了因蛋白質量不穩定或者表達量偏低，以及fed-batch無法保證批次穩定控制等一系列問題，而且去除了中間一些不必要的放大步驟，簡化了生產工藝。從法規層面來看，FDA成立Emerging Technology Team（應對新型技術團隊）對連續連生產持開放和支持的態度，他們認定連續灌注是一項能帶來穩定和更高效生產的技術。同時，由於其豐富的產品線，國內一些大的生物製藥企業考也開始嘗試從傳統的fed-batch向連續生產轉變，以期解決傳統培養工藝無法真正滿足需求的問題。但與此同時，其特定的培養模式也面臨著一些挑戰，比如如何在長時間的培養中防止染菌，驗證從收穫到純化得到的各「亞批次」之間的一致性等，這些問題在企業快速申請IND時會顯得尤為重要。上述討論的工藝開發中的關鍵點看似相互分離，但實則牽一髮而動全身，實際過程中切不可只考慮到某一因素對結果的影響，而應採用多變數分析的方法充分考慮不同變數之間的關係，以及綜合效應對產物表達和質量的影響。因此，要想實現連續生產還需要投入更多的時間和精力，才能將上游和下游真正的融合為一個整體，實現高質量蛋白穩定均一的表達和生產。

參考文獻

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