無創染色體篩查：值得期待的胚胎篩查新技術

全球首個NICS寶寶。從左至右：無錫市婦幼保健醫院主任醫師許倩、美國科學院院士謝曉亮、無錫婦幼保健院生殖中心副主任蔡立義、南京軍區南京總醫院生殖中心主任姚兵、億康基因CEO陸思嘉

撰文 | 彭若詩

責編 | 陳曉雪

近日，美國科學院院士謝曉亮帶領的一個合作團隊報告了一種新的無創胚胎染色體篩查（Noninvasive chromosome screening, NICS）技術，只需要在試管嬰兒胚胎植入前檢測胚胎的培養液中的DNA，就能實現染色體篩查。在無錫婦幼保健院的臨床試驗中，NICS技術已經成功幫助五位病人生出健康寶寶。2016年9月29日，《美國國家科學院院刊》（PNAS）刊發了這一最新臨床的研究成果。

「這一技術應該說對胚胎的安全性，對子代長期的安全性，遺傳病的防控都有著重要的意義。」該研究的通訊作者之一、億康基因公司CEO陸思嘉對《知識分子》說。

無創染色體篩查（NICS）圖示。從體外培養3-5天胚胎的培養液中提取出DNA片段，經MALBAC技術擴增後將這些DNA片段測序並定位到不同染色體上，得到的結果可以用於判斷染色體數目。 製圖：彭若詩

胚胎染色體異常的風險是高齡女性生育面臨的一個重要問題。1996年，美國科學家D.E.Battaglia等人的一項研究表明，20-25歲的女性體內，卵子染色體數目異常的比例是25%，而對於40-45歲女性，這一比例高達79%。染色體異常的卵子受精後，或無法發育成胚胎引起早期流產，或發育成患有唐氏綜合征、帕陶氏綜合征等嚴重染色體疾病的胎兒。

隨著試管嬰兒等輔助生殖技術的廣泛應用，臨床上已經可以做到對卵細胞體外受精。待受精卵發育成胚胎後，選擇染色體數目正常的胚胎植入准媽媽體內。這一技術叫做植入前胚胎遺傳學篩查（Preimplantation genetic screening，PGS），即通過檢測染色體的數目和結構，分析胚胎是存在遺傳物質異常。PGS 可以顯著提高胚胎移植的臨床妊娠率、降低流產率。

不過，目前臨床採用的PGS技術採集標本時需要侵入式的活檢：當胚胎髮育到8細胞期時，從中取出1隻細胞檢測染色體數目。如果正常，還需在胚胎有200多隻細胞時，再取3-5隻檢測確認。這種方法可能對胚胎質量和發育水平造成潛在的影響。謝曉亮等人的論文中指出，雖然目前仍然缺乏對人類胚胎活檢長期影響的評估，但是一些動物研究已經表明胚胎活檢對神經和腎上腺的發展存在負面影響。同時，活檢對醫療人員技術要求很高，需要接受過特殊訓練且經驗豐富的胚胎學專家進行，這顯著增加了PGS用於臨床的成本。

因此，「一個無創而又易於操作的篩選工具將極大地促進胚胎植入前染色體篩查的推廣，從而提高試管嬰兒的成功率」，該研究論文介紹說。

2013年，義大利研究者Paola Scaruffi團隊報道，在體外培養試管嬰兒胚胎時，培養液中存在少量游離的基因組和線粒體的DNA，這些DNA很可能來源於胚胎自然發育過程中凋亡的細胞。研究者們立即想到，如果能夠從這些培養液中的DNA中提取出染色體數目的信息，用於判斷胚胎中染色體數目，就可以實現對胚胎的零傷害，即無創染色體檢測。

實際上，這一思路雖然清晰，但在實際操作中依然面臨著巨大的挑戰。陸思嘉介紹說，胚胎外培養液中可獲得的DNA數量很少，而且是碎片化的，「因此需要用一種非常好的DNA擴增技術，這也是為什麼使用MALBAC這種單細胞擴增技術來做NICS」。

「多重退火環狀循環擴增法」（MALBAC）是2012年謝曉亮在哈佛的實驗室發明的一種新的單細胞擴增方法。與傳統1變2、2變4的鏈式擴增不同，MALBAC每次都只對原始模板擴增，因此，一次複製出錯對整體產物質量沒有顯著影響。「哪怕單個細胞的30億個鹼基對里有一個鹼基錯了，我們都能看出來，而且沒有假陽性。這種方法比此前廣泛應用的MDA（多重置換擴增）方法能更準確地檢測點突變和拷貝數變異。」2015年7月，謝曉亮在未來論壇舉辦的一個報告上介紹說。值得注意的是，本次研究的通訊作者之一陸思嘉正是MALBAC的主要發明人之一。

據論文報道，徵得捐獻者同意後，研究者在體外通過人工受精製造出42個胚胎，在這些胚胎髮育到第3天至第5天時，取出培養液，擴增其中的DNA片段，並將各片段通過序列比對定位到不同染色體上。通過不同染色體上片段數目的多少，來判斷胚胎中染色體數目。作為對照，研究者將這42個胚胎中DNA提取出，檢測其中實際染色體數目，與從培養液中DNA判斷出的比較。結果表明，培養液中DNA檢測方法成功判斷出了21個染色體數目正常的胚胎和15個染色體數目不正常的胚胎，準確率達84%。剩下的6個錯誤判斷中，有4個是正常胚胎被誤判為不正常（假陽性），這可能是胚胎髮育過程中自發排出了分裂異常的細胞導致。另外有2個染色體數目不正常的胚胎被誤判為正常（假陰性），可能來自父親或母親正常細胞的污染。相對於目前活檢技術95%的準確率來說，這一準確率雖然較低，但由於無創性，可以先做NICS檢測，對於異常結果再做活檢以排除假陽性。因此，NICS技術具有很高的臨床應用價值。

在臨床試驗中，研究者先招募了一個尋求輔助生殖的病人，該病人14和15號染色體的一部分發生交換，導致生殖細胞中染色體數目變異更容易發生。研究者通過人工受精得到3個胚胎，並用NICS對胚胎培養液中DNA進行檢測。結果表明，其中1個胚胎染色體數目正常，另兩個胚胎14或15號染色體數目都不對。正常的胚胎被植入母體，19周後通過傳統羊水穿刺技術驗證了胚胎染色體數目正常。今年3月5日，全球首個接受無創胚胎染色體篩查的試管嬰兒健康誕生。

接下來，研究團隊又招募了6例經歷過反覆流產、反覆植入失敗或染色體異常的病人。在NICS技術的幫助下，其中5例成功懷孕，4例已經生出健康的寶寶。「目前我們在無錫總共做了20多例病人，綜合的成功率達到60%多，這個比例比不做檢測顯著提高。」 陸思嘉說。

「我們也是第一次提供了40多個胚胎的、嚴格比對的實驗。」陸思嘉介紹，此前雖然有一些關於無創胚胎染色體篩查的零星報道，但並沒有人嚴格地去做這個實驗。這個系統性的實驗「真正衡量了這個技術的有效性、準確性、特異性」。

關於該技術的應用前景，陸思嘉認為，經過完善後的NICS可以推廣到大部分試管嬰兒的病例。「我們正在組織一些多中心的臨床試驗，通過妊娠率、活產率等臨床指標，和隨訪子代的安全性，進一步證實它的可靠性。NICS技術如果通過了進一步驗證，我認為是完全可以取代現在的染色體篩查技術的。」

陸思嘉同時強調，雖然NICS未來進一步的研發和發展，有希望用於某些遺傳病的篩查，但其當前的定位還是用於胚胎優選。由於培養液中DNA片段化嚴重，NICS技術無法覆蓋整個染色體序列，所以對於非染色體數目相關的基因疾病來說，目前還是活檢更為準確。

該研究由北京大學、無錫市婦幼保健院、南京軍區總醫院和億康基因共同完成。

參考文獻：

Juanjuan Xu, Rui Fang, Li Chen, Daozhen Chen, Jian-Ping Xiao, Weimin Yang, Honghua Wang, Xiaoqing Song, Ting Ma, Shiping Bo, Chong Shi, Jun Ren, Lei Huang, Li-Yi Cai, Bing Yao, X. Sunney Xie, and Sijia Lu(2016)，Noninvasive chromosome screening of human embryos by genome sequencing of embryo culture medium for in vitro fertilization,PNAS.

Battaglia, D. E., Goodwin, P., Klein, N. A., & Soules, M. R. (1996). Fertilization and early embryology: Influence of maternal age on meiotic spindle assembly oocytes from naturally cycling women. Human Reproduction, 11(10), 2217-2222.

Stigliani, S., Persico, L., Lagazio, C., Anserini, P., Venturini, P. L., & Scaruffi, P. (2014). Mitochondrial DNA in Day 3 embryo culture medium is a novel, non-invasive biomarker of blastocyst potential and implantation outcome. Molecular human reproduction, 20(12), 1238-1246.

Stigliani S, Anserini P, Venturini PL, Scaruffi P (2013) Mitochondrial DNA content in embryo culture medium is significantly associated with human embryo fragmenta- tion. Hum Reprod 28(10):2652–2660.

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