專訪胡文輝教授：搭乘CRISPR快車，導彈式靶向剔除潛伏HIV

人類與艾滋病已經鬥爭了超30年，從最初的絕症到現在的有效治療，艾滋病正朝著慢性疾病的方向慢慢轉變。但是，科學家們一直未曾放棄「治癒艾滋病」的夢想，他們正在努力研發能夠治癒或者預防艾滋病的「良方」。

3月30日，Cell子刊《Molecular Therapy》在線發表了一篇題為「In Vivo Excision of HIV-1 Provirus by saCas9 and Multiplex Single-Guide RNAs in Animal Models」的文章，揭示了科學家們首次利用「魔剪」技術CRISPR有效剔除人源化小鼠多個器官中潛伏的人類艾滋病病毒。

「利用基因編輯治療艾滋病」的研究思路從何而來？該技術如何應對HIV變異問題？它對於艾滋病治療將會產生怎樣的意義？帶著這些疑問，生物探索有幸採訪到這篇文章的最後通訊作者、美國天普大學醫學院的華人科學家——胡文輝教授。他表示：「這種『導彈式靶向剔除潛伏病毒』的嘗試給以戰勝艾滋病為終點的科學研究帶來新的方向，它有望為徹底治癒艾滋病帶來希望。」

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「清除潛伏的HIV」——這是胡文輝教授自2008年在天普大學成立獨立實驗室以來一直試圖克服的難關。他表示：「艾滋病難以治癒的根源正是潛伏於人體內細胞中的艾滋病病毒。」

根據世界衛生組織的統計數據，全球約有6000萬人感染艾滋病毒，其中2000萬人已死亡。近4000萬感染者，75%集中在15個國家，而中國位列其中。人類免疫缺陷病毒（HIV）入侵人體，主要通過攻擊T淋巴細胞瓦解免疫系統，致使患者免疫功能減弱，增加感染各種疾病或者發生惡性腫瘤的概率，進而威脅生命。

慶幸的是，隨著核苷類逆轉錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、抗逆轉錄病毒藥物的相繼問世，艾滋病不再是無葯可治的絕症。「但是，轉變成慢性病的艾滋病依然面臨多種問題，包括藥物副作用、神經損害、心血管損傷等等。」胡文輝教授強調，「在雞尾酒療法時代，仍有一半以上的艾滋病患者伴隨有不同程度的神經認知功能障礙，而且輕型神經艾滋病（Neuro AIDS）患者數量正逐年增加。 」

HIV作為逆轉錄病毒，變異性特彆強。同時，它們通過將遺傳物質永久性插入宿主細胞DNA中，形成病毒庫。一般情況下，這些潛伏的病毒處於休眠狀態，一旦脫離藥物抑制，它們便會重新猖獗。所以，治癒艾滋病必須跨過「潛伏病毒」這一難關。

近年來，科學家們提出了多種針對潛伏病毒的方法，包括「先激活後絕殺」（Shock and kill）、敲除病毒（Knockout）、永久性潛伏（Permanent silencing）等等，他們希望通過實現從有效治療到徹底治癒的轉變，真正造福於患者。現在，胡文輝教授與同校同事Kamel Khalili教授、美國匹茲堡大學楊文彬教授課題組合作，第一次在動物模型上成功證實，利用基因編輯技術多靶點、高效剔除潛伏病毒的可行性。

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當被問及「利用基因編輯治療艾滋病」這一研究思路的由來，胡文輝教授表示：「利用基因編輯技術敲除HIV是解決潛伏病毒的一個重要思路。在我們試圖應用傳統基因打靶技術、ZFN和TALEN基因編輯技術尚未成功之際，張峰團隊開發出可編輯人類基因組的CRISPR/Cas9系統，這給我們提供了一個很好的技術選擇。」藉助於引導RNA（gRNA）和Cas9核酸酶的完美配合，這一「魔剪」技術能夠精準實現目標基因位點的切割、編輯工作。

2014年，胡文輝教授課題組和Kamel Khalili教授課題組合作，以實驗室培養的潛伏有HIV病毒的人類細胞係為材料，首次成功利用CRISPR實現潛伏病毒的永久性清除，驗證了最初的構想。這一利用基因編輯技術將艾滋病病毒從人類基因組中剔除的文章在《PNAS》期刊一經發表，就引起了業界的廣泛關注。

隨後2年多，他們從體外試驗轉向動物試驗，不斷優化這一有望徹底治癒艾滋病的治療方案，並先後在《Scientific Report》、《AIDS》、《Gene Therapy》期刊發表研究成果。

這一篇最新發表在《Molecular Therapy》期刊的文章再一次揭示了有關靶向根治艾滋病的動物試驗的可行性和有效性。

首先，胡文輝教授帶領文章一作、博士後尹超然等課題組成員篩選和優化了多個靶向剪接的腺相關病毒（AAV）的基因療法，在人類HIV轉基因小鼠成功獲得高效率剔除已經整合的HIV基因組（DNA），且能夠顯著抑制（高達60-95%）多個器官組織中HIV的基因表達（RNA 轉錄）。

隨後，胡文輝教授課題組與楊文彬教授課題組合作，使用改建的鼠類HIV病毒（EcoHIV）建立艾滋病小鼠急性感染模型。因為人類HIV不能感染鼠類動物，他們將帶有生物發光報告基因的EcoHIV病毒感染免疫缺陷裸鼠，同時給予HIV多靶點/saCas9的AAV-DJ8（人工合成的AAV血清型，綜合了8種自然AAV的血清型特性），然後用活體動物生物發光圖像檢測儀（BLI）長時間（19天）監測動物全身的EcoHIV動態變化。他們首次證明多靶點基因編輯的AAV-DJ8基因療法能夠高效剔除鼠類HIV病毒（可達96%），並顯著減輕HIV急性感染。

最後，他們在人源化小鼠HIV模型上證明多靶點/saCas9的 AAV-DJ8基因療法能有效剔除多個器官組織中的人類HIV潛伏感染病毒。他們用人類HIV活病毒感染人源化BLT小鼠 (移植有人骨髓、肝和胸腺組織或細胞的免疫缺陷小鼠，其被艾滋病病毒感染和潛伏的方式與人類一致）建立HIV潛伏感染模型，給予HIV多靶點/saCas9的AAV-DJ8，2-4周後在多個器官組織中檢測到HIV基因組的成功切除。

圖示：腺相關病毒基因療法將多靶點基因編輯「魔剪」導入HIV感染小鼠體內準確剔除HIV病毒基因組，進而抑制病毒轉錄和消除病毒複製。

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為什麼設計多個靶點？胡文輝教授表示有兩個原因：第一，在HIV轉錄區和結構區設計了2-4個sgRNA實現多靶點切除，這有利於顯著增加其剔除效率。第二，艾滋病病毒基因易於突變，應用單靶點基因編輯有可能會出現病毒逃逸現象。他認為：「多個有效靶點同時突變的可能性極小，即便某些個體患者出現突變，我們也可以快速重新設計和構建相關的Cas9基因編輯系統。這正是Cas9基因編輯用於精準醫學的優勢所在。」

針對CRISPR系統的脫靶問題，胡文輝教授告訴生物探索，他們早期發表的全基因組測序研究結果以及其它實驗室的研究結果並沒有發現脫靶效應。即使萬一單個靶點存在脫靶的可能，但是兩個或者多個脫靶點落在同一個正常功能性基因（僅占人類基因組的1.5%）的可能性微乎其微。

胡文輝教授強調，相比於目前的抗逆轉錄病毒藥物，這一基於多靶點基因編輯的基因療法最大的優勢之一在於安全。團隊精心篩選的靶點sgRNA都是針對外源性病毒基因的，它們對宿主靶細胞的基因組具有高度特異性，從而確保了在剔除病毒過程中不干擾宿主細胞的存活和功能。他覺得，這種「只殺病毒不殺細胞」的效果至關重要。

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胡文輝教授表示：「目前，基因編輯療法尚不能100％清除動物體內的艾滋病病毒，但能夠顯著降低潛伏病毒量。」談及這一研究成果距離臨床試驗的時間，胡文輝教授坦言，儘管目前最看好的AAV基因療法已經在世界各地進行臨床試用，但用於艾滋病病人還有很多挑戰和未知需要面對和解決：

第一，艾滋病治療效果的評估。目前，科學家們只是在活體動物身上取得針對艾滋病的腺相關病毒基因療法的高效病毒剔除結果，相關的治療效果評估研究仍在進行之中，尤其是更接近於HIV病人的靈長類動物艾滋病模型，靶向剔除艾滋病病毒的可行性和有效性亟待測試。

第二，基因轉移效率難題。在多細胞、組織和器官水平，治療艾滋病和其它感染性疾病以及遺傳性疾病和癌症的確切效果都取決於基因轉移效率。

第三，潛伏的宿主細胞。目前，國際公認的HIV潛伏細胞包括T細胞、單核/巨噬細胞。而我們已有的腺相關病毒血清型是否足夠轉導所有的潛伏T細胞？另外，包括神經幹細胞在內的其他細胞是否是尚未被發現的潛伏宿主細胞？

第四，CRISPR/Cas9技術自身的不斷完善。Cas核酸酶的不斷小型化和多元化？基因編輯的效率優化和特異性優化？

未來，能否找到靶向所有免疫細胞或者HIV潛伏細胞特異的基因療法？是否可以藉助納米科技、類病毒顆粒優化CRISPR系統？採訪最後，胡文輝教授暢談了很多新想法。他說：「對於基因治療艾滋病等疑難雜症的應用前景，我很有信心，也充滿期待。下一步，我們將繼續探索更有效、安全的基因療法和細胞療法。」

課題組合照

關於胡文輝教授

胡文輝博士畢業於中國協和醫科大學基礎醫學研究所，是天普大學醫學院（TUSM）代謝疾病研究中心和病理學系的終身副教授，同時也是四川大學華西醫院的客座教授。他的研究工作獲得多項美國國家衛生院（NIH）基金資助，其研究方向集中在艾滋病治癒、神經發育障礙、肥胖和胃腸道神經肌肉調節，先後發表學術文章70餘篇，並擁有4項專利。