ABPP揭示脂肪醯胺水解酶抑制劑BIA 10-2474的脫靶蛋白

大家好！本周和大家分享一篇發表在Science上的文章，「Activity-based protein profiling reveals off-target proteins of the FAAH inhibitor BIA 10-2474」，本文一位通訊作者是來自Leiden University的Mario van der Stelt，他的研究方向主要是內源性大麻素的藥物化學；本文另一位通訊作者是來自Erasmus University Medical Centre的Steven A. Kushner，他的主要研究方向是神經生物學。

首先作者合成了BIA 10-2474和BIA 10-2639（已確認的BIA 10-2474的還原代謝物），隨後作者在in vitro和in situ條件下建立底物水解測定的assay檢測了BIA 10-2474和PF04457845的效力，發現BIA 10-2474在in vitro條件只有中等大小的IC50，但在in situ條件下即在HEK293T細胞中表現出較強的FAAH抑制活性。作者使用基於活性的蛋白質組學方法（ABPP）來確定人類細胞和組織中與BIA 10-2474的相互作用蛋白質，使用活性位點導向的探針（例如氟代膦酸酯（FP）或β-內酯）與絲氨酸水解酶作用。熒光FP探針競爭的gel-based ABPP實驗驗證了BIA 10-2474和PF04457845在inin vitro和in situ的相對效力，作者假設BIA 10-2474在細胞內活性的升高或許與化合物在細胞內累積有關。隨後在生物素化的FP探針競爭的同位素標記的MS-based ABPP實驗中，作者主要選取人類結腸癌細胞SW620進行實驗，因為在其他哺乳動物中細胞中沒有觀察到神經毒性，檢測了大範圍的不同抑制劑濃度的效果。作者的實驗結果顯示BIA 10-2474和PF04457845在測試最低濃度（0.2μM）下均表現出對FAAH的良好選擇性，隨著濃度的升高，PF04457845基本保持對FAAH的選擇性抑制作用，除了一個主要的脫靶蛋白FAAH2。BIA 10-2474及其代謝物BIA 10-2639則出現顯示出多種脫靶蛋白，包括FAAH2和若干脂質水解酶。在10和50μM濃度的BIA 10-2474中，其中一些脫靶蛋白，如ABHD6和CES2，幾乎被完全抑制。隨後作者在HEK293T細胞中重組表達多種代表性脫靶蛋白，gel-based ABPP驗證BIA 10-2474對這些蛋白的抑制作用。多數BIA 10-2474脫靶蛋白與細胞內脂質代謝有關，其中大多數在人類腦組織中大量表達。緊接著作者檢測了長期暴露於BIA 10-2474是否改變人類皮層神經元中的脂質代謝，使用DMSO或BIA 10-2474或PF04457845處理皮質神經元，進行基於MS的脂質組分析，觀察脂質代謝的變化。PF04457845誘導產生的脂質代謝變化弱於BIA 10-2474。

doi: 10.1126/science.aaf7497.

http://science.sciencemag.org/content/356/6342/1084/tab-pdf

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