首次揭示T細胞淋巴瘤的表觀遺傳調控機制

最新 07-12

編者按

表觀遺傳基因組的動態變化往往有著全局性，越來越多的證據表明這些變化又指向疾病的發生、發展，帶有大量的信息。在精準醫療等概念風起雲湧的今天，表觀遺傳，這個帶有著強烈調控意味和時空個性化特徵的辭彙不禁給人一個想像的空間。此文中，犀利的全基因組ATAC-Seq技術結合轉錄活性位點的動態變化概念、患者的藥物反應，清晰闡述了表觀遺傳機制對於個性化疾病的重要對應作用，展示了一個穩定、微量表觀遺傳圖譜測序技術的強大潛力。其中，作者使用「指紋」一詞用於描述獲得的富集圖譜及其個性化分析能力，這個類比於形於神皆是工整。

中國科學技術大學瞿昆教授課題組聯合美國斯坦福大學Howard Chang實驗室，以共同第一作者、第一單位的身份在Cancer Cell上發表了題為「Chromatin accessibility landscape of cutaneous T cell lymphoma and dynamic response to HDAC inhibitors」的文章。該論文以T細胞淋巴瘤(CTCL)為研究對象，利用ATAC-seq技術，首次揭示了CTCL的疾病特異性、患者特異性及細胞特異性表觀遺傳調控機制，並首次發現了個性化(personalized)表觀遺傳調控機制對抗癌藥物敏感性的決定性作用，說明對癌症表觀遺傳基因組研究的重要性。

CTCL是一種由T淋巴細胞克隆性增生造成的較為罕見的複雜性疾病，晚期的CTCL，如Sézary綜合症，癌細胞可以轉移至血液，導致T細胞白血病，是一種非常致命的疾病，然而此前對該疾病基因表達調控的研究還很匱乏。目前，美國葯監局（FDA）已批准的組蛋白脫乙醯酶抑制劑（Histone deacetylase inhibitor, HDACi），如Vorinostat和Romidepsin等藥物靶向患者的表觀遺傳基因組來治療Sézary綜合症。理論上，這兩種藥物都是希望通過抑制細胞內組蛋白脫乙醯酶的作用，提高細胞染色質的乙醯化水平，鬆弛核小體結構，從而增強各種轉錄因子和協同因子與DNA的特異性結合，激活基因，尤其是腫瘤抑制基因的轉錄，以此來抑制腫瘤生長、達到治療疾病的目的。然而，由於臨床樣品稀少，傳統實驗技術，如DHS-seq等並不能實現檢測微量人類活體細胞的染色質開放位點，因此我們並不清楚患者在接受HDACi抗癌藥物治療後，染色質是否真如所期望的那樣被打開？腫瘤抑制基因是否有被激活？當然也無從知曉是否存在腫瘤特異性，甚至患者特異性的表觀遺傳指紋？如果有，那它又是如何調控患者對藥物的敏感性？這些問題的解答，都將有助於醫生為患者選取最佳的臨床治療方案。

基因表達調控是遺傳和表觀遺傳修飾共同作用的複雜系統，表觀遺傳基因組通過組蛋白的位置、重排和化學修飾、DNA甲基化、非編碼RNA的表達、以及轉錄因子調控網路等各種因素一起工作來決定細胞表型。由於各種調控原件大多作用於DNA轉錄活性位點，因此對錶觀遺傳基因組研究的一個核心問題是如何在全基因組層面確定染色質開放位點。ATAC-seq是一種利用Tn5轉座子插入到染色質開放位點的雙鏈DNA，並隨後建庫測序的技術，該技術可以快速準確的檢測全基因組DNA轉錄活性位點、DNA-蛋白相互作用、核小體分布等表觀遺傳信息。ATAC-seq的優點是靈敏度高，只需要五百到五萬個細胞，實驗時間短，從建庫到數據初步分析完成，只需要十個小時，因此非常適合對少量臨床樣本的研究。

本文作者通過流式分離正常人和患者新鮮血液中的CD4+T細胞，利用ATAC-seq技術快速檢測正常人和患者血液中微量活體T淋巴細胞的染色質開放位點，整合各類組學數據和生物信息分析技術，深度解析CTCL表觀遺傳指紋，構建CTCL腫瘤特異性、患者特異性和細胞特異性基因調控網路。作者還通過追蹤患者在組蛋白脫乙醯酶抑制劑（HDACi）抗癌藥物治療過程中各個時間點的表觀遺傳狀態，首次在時間尺度上深入研究表觀遺傳基因組和關鍵性轉錄因子對患者藥物敏感性的動態調控機制，並準確預測患者對HDACi抗癌藥物的敏感性。

文章分別從實驗數據的可靠性，腫瘤細胞的特異性表觀遺傳指紋，關鍵性的調控因子，對HDACi抗癌藥物的應答特異性等方面進行闡述。

1）揭示CTCL的表觀遺傳指紋，構建疾病特異性和患者特異性基因調控網路。

圖1. 實驗設計和T淋巴細胞表觀遺傳圖譜

利用流式分選提取出CD4+T細胞，對部分具有可識別T細胞受體變異β的患者樣品，通過流式細胞儀成功的分選出患者的宿主和腫瘤細胞（圖1A，B），並順利建庫。結果顯示在各個組分（正常、宿主、混合及腫瘤細胞）、各個患者（P11-P1409）中ATAC-seq信號均非常清晰且具有很強的信噪比，此外和H3K27Ac ChIP-seq信號也非常吻合，說明ATAC-seq技術的確檢測到了T淋巴細胞DNA上的轉錄活性位點（圖1C）。

通過比較正常、宿主、混合及腫瘤細胞的表觀遺傳圖譜，發現數千個DNA調控位點存在顯著性差異，並且可以明顯的聚類成三個不同的簇，顯示正常細胞、健康人和CTCL腫瘤細胞特異性的表觀遺傳指紋（圖2A）。例如，在PIK3R1基因的內含子裡面有兩個DNA調控位點，在正常和宿主細胞中更開放，印證了先前關於PI3K/Ark信號通路缺失引起Sézary綜合症的認識；對於在病原體識別和先天免疫激活中起著關鍵性作用的基因TLR4附近的調控位點，只在健康人的T細胞中開放，說明患者T細胞部分免疫功能缺失。相反，在基因HDAC9附近，卻發現多個DNA調控位點只在混合或腫瘤細胞處於活躍狀態（圖2B-2D）。對基因組的分布特性的進行微分，包括五個基因功能元件：啟動子、轉錄區、活性增強子，弱增強子和異染色質（圖2E）。

圖2. CTCL腫瘤細胞特異性表觀遺傳指紋

通過比較正常和混合CTCL 、宿主和腫瘤細胞之間的共同的差異性的位點來定義CTCL的表觀遺傳特徵指紋（圖3A）。正常和腫瘤細胞之間的表觀遺傳變化是高度一致的（圖3B）。以IFNG基因為例，在正常和宿主細胞中該基因的調控位點明顯比混合和腫瘤細胞中要更開放，RNA-seq數據也證明該基因在宿主和腫瘤細胞中的表達量存在顯著性差異（圖3C）。並且總體上講，基因周圍的染色質越開放，基因的表達量越高（圖3D），說明染色質開放程度和RNA表達量之間存在關聯性。

圖3. 染色質開放程度和RNA表達水平顯著相關

通過對具有顯著性差異的DNA轉錄調控位點進行motif分析，並利用Genomica中的ModuleMap演算法，作者發現多個關鍵性轉錄因子，如PU.1、GATA、RUNX、STAT等調控細胞正常分化的轉錄因子富集在正常細胞和樣品中，說明CTCL可能是一個正常功能喪失型的疾病（圖4A）。相反，在患者樣品中，除了已知的NF-kB轉錄因子會導致T細胞淋巴瘤，並且富集在幾乎所有的患者樣品中，作者發現不同的患者樣品中還富集其他不同的轉錄因子motif，例如CTCF、Jun-AP1、以及以EGR、SMAD、MYOD、MYC和KLF為代表的轉錄因子群。這三個轉錄因子群在患者樣品中的富集方式互斥，說明導致患者疾病可能存在不同的機制。通俗的說「幸福的家庭（指正常人）都一樣，不幸的家庭（指患者）卻各有各的不幸」。作者還將富集的motif及其相應的轉錄因子按照它們的顯著性排序，找到對維持細胞正常功能以及導致細胞癌變的關鍵性轉錄因子（圖4B），以及幾個關鍵性轉錄因子在不同細胞類型中不同的motif-footprints（圖4C）。

圖4. 調控CTCL的關鍵性轉錄因子

2）研究患者特異性表觀遺傳狀態如何決定患者對HDACi抗癌藥物的敏感性。

在現有的8位患者中，有6位分別通過口服Vorinostat和靜脈注射Romidepsin接受治療，還有2位在不同時間分別接受兩種藥物治療（圖5A，B）。通過比較患者在接受藥物治療前後的染色質構象，作者發現：所有接受Vorinostat治療的患者的染色質都沒有被廣泛打開，臨床上這些患者對Vorinostat不敏感；部分注射Romidepsin的患者的染色質有被顯著打開，臨床上他們對Romidepsin敏感，而部分患者的染色質沒有被打開，臨床上他們對Romidepsin不敏感。通過系統性的研究染色質開放程度和藥物敏感性之間的關係，作者發現染色質開放程度的變化和患者對藥物的敏感性顯著相關（圖5C）。

圖5. HDACi藥物治療下的患者個性化染色質動態變化

T淋巴細胞存在多種細胞亞群，作者利用CIBERSORT方法解析了正常、宿主、混合以及腫瘤細胞中各主要亞群的比重，發現Treg和Th2細胞亞群在混合和腫瘤細胞中明顯富集，說明這兩類細胞有可能主導了CTCL中T細胞的癌變（圖6A，B）。此外，作者發現：同一患者（P11）在接受不同藥物（Vorinostat和Romidepsin）後的染色質構象變化是不同的；不同細胞（混合、宿主和腫瘤）在接受同一藥物（Romidepsin）治療下的染色質構象變化也是不一樣的（圖6C）；此外，相對於混合和腫瘤細胞，宿主細胞在接受藥物治療後的反應更接近於CTCL表觀遺傳指紋。這些結果暗示：同一患者對不同藥物的臨床反應可以在染色質構象層面得到顯示；存在細胞特異性的藥物反應機制；那些在接受藥物治療後癥狀得到緩解的患者可能是通過使宿主細胞變得更正常得到治癒的。

圖6：細胞種群特異性HDACi藥物反應

3）整合基因組和表觀遺傳數據繪製CTCL的遺傳變異圖譜。

通過ATAC-seq數據對正常、混合、宿主、腫瘤細胞的DNA拷貝數進行分析，利用人類染色體圖顯示人類基因組DNA的拷貝數在各細胞類型中的差異。作者證實了在混合和腫瘤細胞中多個已被報道的遺傳變異，如chr4q、chr8q和chr17q的增加，chr10q和chr17p的缺失等，並發現這些變異並沒有發生在正常人或者患者的宿主細胞中（圖7A，B）。有趣的是，作者發現遺傳層面的DNA拷貝數差異並不能反映患者對藥物的敏感性，相反，表觀遺傳層面的轉錄因子調控機制（圖4A）卻可以準確的預測患者對藥物的應答情況（圖7C，D），再一次說明對患者表觀遺傳基因組研究的重要性。

圖7：CTCL患者染色體遺傳和表觀遺傳變異圖譜

總結：

該論文是首個通過直接獲取CTCL患者活體T細胞，通過ATAC-seq獲得腫瘤特異性、患者特異性和細胞特異性表觀遺傳指紋的工作。通過跟蹤研究患者在接受HDACi抗癌藥物治療後DNA轉錄活性位點的動態變化，結合患者對藥物的反應，文章實時構建了癌症個性化表觀遺傳調控網路，發現了調控細胞癌變的關鍵性轉錄因子，為新的靶向治療方案提供依據，也為研究其他疾病的個性化表觀遺傳調控機制建立模板。綜上所述，通過類似方法，大規模收集臨床樣本，發展和利用最新的實驗和分析技術，從時間和空間尺度深入系統的研究人類疾病的表觀遺傳基因組，具有鮮明的特色和創新性，並將對推動精準醫療的發展有非常重要的科學意義。

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