PD-1/PD-L1非單抗抑制劑專利

程序性細胞死亡的蛋白質1（programmed cell death protein，PD-1，也叫CD279），是一種表達於T細胞或前B細胞的表面受體蛋白，PD-1與其配體PD-L1或PD-L2結合，會抑制T細胞的活化，表現為免疫檢查點作用。腫瘤微環境中PD-L1或PD-L2的過表達會引起瘤體內免疫反應的抑制。抗PD-1/PD-L1抗體可干擾PD-1與配體的結合，從而抑制T細胞的去活化，PD-1/PD-L1成為免疫檢查點抑制劑開發最活躍的通路之一。本文對2010~2015年PD-1/PD-L1非單抗類抑制劑專利進行簡要分析。

2015年，人類PD-1與PD-L1複合物晶體結構首次被解析出來，研究者們開始嘗試設計小分子抑制劑。然而，由於複合物結構表面口袋不深，表現為平坦狀和疏水性，假陽性率較高，增加了設計靶向小分子化合物的難度。此外，PD-1/PD-L1拮抗劑的較強疏水作用，在後續的開發中會存在化合物毒性、選擇性、水溶性等問題。

目前針對PD-1/PD-L1的蛋白-蛋白相互作用（PPI）的非單抗類抑制劑包括小分子、肽、環肽化合物、大環化合物等。來自哈佛大學的一個研究小組參考單抗類結構開發了磺胺衍生物（1）和（2）（圖1），二者在轉基因小鼠表達PD-1的T細胞IFNγ釋放試驗中表現出了拮抗活性。

圖1：哈佛大學研究小組開發的PD-1通路小分子拮抗劑。

百時美施貴寶公司（BMS）開發了一系列與PD-L1結合的小分子化合物（3），結構上為三芳環及一個單鄰位取代聯苯，另一苯環連接到聯苯，並含有亞甲基胺部分。使用同質時間分辨熒光方法（HTRF）進行生物活性的測定及化合物對PD-1/PD-L2和PD-L1/CD80的選擇性。典型的化合物有BMS-8、BMS-37、BMS-202、BMS-230、BMS242（圖2）。共結晶及生物物理學方法已證實了化合物BMS-202和BMS-8對PD-1/PD-L1的拮抗作用，該類化合物的其它體內外生物活性尚未開展進一步測試。

圖2：百時美施貴寶公司合成的PD-1/PD-L1小分子抑制劑。

使用時間分辨熒光共振能量轉移（TR-FRET）測試化合物的PD-1/PD-L1的高通量篩選試驗中，會出一些假陽性的現象，如水楊酸鹽化合物NCI 211717和NCI 211845（圖3），原因是該化合物的水楊酸螯合基團與穴狀配體銪熒光共振能量轉移的供體發生相互作用，導致檢測信號的變化。

圖3：假陽性PD-1/PD-L1抑制劑

很多的PD-1/PD-L1抑制劑是基於肽結構進行設計的，如二唑和尿素等生物電子等排體結構。Aurigene公司研究人員設計了一系列能夠干擾PD-1信號通路的環肽化合物作為免疫調節劑。通式結構（4）中心是一個1取代氧雜或1-硫代-3,4二唑片段連接到2位絲氨酸或蘇氨酸側鏈上，另一氨基酸或肽與5位相連，二肽與尿素單元相連，5位氨基酸多為天冬醯胺、谷氨醯胺、天冬氨酸和谷氨酸等。生物活性測試方法為PD-1/PD-L1重組小鼠的脾細胞拯救試驗，如化合物（5）100nM濃度的小鼠免疫細胞拯救率為92%（圖4）。

圖4：PD-1/PD-L1相互作用的氧和噻二唑核結構的擬肽類抑制劑

2015年，鄭州大學和清華大學的研究團隊聯合開發了首個靶向PD-1/PD-L1相互作用的抗水解D-肽拮抗劑，經改造優化的化合物DPPA-1結合PD-L1的體外親和力為0.51Μm，小鼠體內細胞水平和腫瘤耐受實驗結果表明DPPA-1能夠有效地破壞PD-1/PD-L1相互作用（圖5）。

Aurigene公司研究人員開發了抗癌化合物（10），PD-1與PD-L1/PD-L2結合的關鍵胞外區域的序列與已知配體結合區域重疊或接近，該序列被識別出來並作為出發點設計和評估人或小鼠的PD-1序列。化合物（10）具有高效拮抗PD-1信號的作用，皮下給葯後在體內釋放，臨床前試驗表明能夠抑制腫瘤的生長和轉移，且耐受性良好，在任何劑量下沒有明顯的毒性，其結構如圖5所示。

在此基礎上，BMS公司化學家開發了大環肽結構（11），HTRF與細胞結合分析顯示其在nM水平上對PD-1/PD-L1具有抑制作用。此外，該肽類與抗PD-1單抗nivolumab（BMS-936558、MDX-1106）具有競爭性結合作用，能夠增強巨細胞病毒（CMV）和HIV病毒特異性T細胞IFNγ分泌作用，故對腫瘤等過度增殖性疾病具有一定的效果。

圖5：a）抗水解D肽拮抗劑靶向作用PD-1/PD-L1；b）大環肽類抑制劑；c）PD-L1肽拮抗劑（10）及其PD-1相似序列。

相對單抗來說，靶向PD-1/PD-L1相互作用的小分子化合物是備受期待的。由於PD-1/PD-L1結合口袋的強疏水結構，給小分子的設計帶來了一定的難度，需要解決分子量大、選擇性差、溶解度低、口服生物利用度低、毒性大等問題。目前報道的化合物也尚未有進一步的臨床試驗信息，處於起步階段的小分子抑制劑的應用有待於進一步的開發。

參考資料：

1. Collin M. Immune checkpoint inhibitors: a patent review (2010-2015).[J]. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2016, 26(5):555-564.

2. Zarganestzitzikas T, Konstantinidou M, Gao Y, et al. Inhibitors of programmed cell death 1 (PD-1): a patent review (2010-2015).[J]. Expert Opinion on Therapeutic Patents, 2016:1.

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