咬合紊亂導致顳下頜關節髁突異常改建

本文刊登於《中國實用口腔科雜誌》2017年6期335-340頁

摘要：咬合紊亂與顳下頜關節紊亂病的關係一直是現代口腔醫學研究的熱點問題之一。筆者課題組通過建立咬合紊亂動物模型，觀察到顳下頜關節髁突的異常改建甚至退行性變。咬合紊亂產生的異常生物力可以影響髁突軟骨細胞的增殖、分化和凋亡，細胞外基質降解和鈣化，以及軟骨下骨吸收等一系列變化，是髁突退行性改變的重要機制。文章就實驗性咬合紊亂對髁突的影響進行綜述。

關鍵詞：咬合紊亂；髁突；異常改建

顳下頜關節紊亂病（temporomandibular disorders，TMDs）與咬合紊亂的關係是口腔醫學研究的重要內容。顳下頜關節骨關節炎（osteoarthritis，OA）是TMDs的重症類型，包括關節軟骨的退行性變和軟骨下骨的變化。為了闡明TMDs的病理機制，筆者課題組曾使用猴［1］、兔［2］和大鼠［3-4］ 建立漸進性咬合紊亂動物模型，並先後使用大鼠［5］和小鼠［6］建立單側前牙反牙合（unilateral anterior crossbite，UAC）動物模型，均觀察到髁突軟骨和軟骨下骨的退行性變及一系列分子變化。本文就咬合紊亂導致髁突退行性變的特點和分子機制進行綜述。

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咬合紊亂導致髁突形態學變化的特點

漸進性咬合紊亂可導致猴［1］、兔［2］、大鼠［3-4］的顳下頜關節（temporomandibular joint，TMJ）退行性變，主要表現為：髁突表面軟骨層變薄，層次結構紊亂；表面纖維增生，形成纖維乳突狀結構突入深層組織；骨小梁排列紊亂。嚴重的咬合紊亂可導致以無菌性骨壞死為主的軟骨退行性變，且隨時間延長病變程度加重［4］。UAC動物模型刺激早期（2周）便有明顯的髁突肥大軟骨細胞的超微結構損傷和損傷細胞周圍軟骨基質的鈣化［5］，8周時已經開始出現明顯的無細胞區，病變區軟骨細胞發生凝固性壞死［7-8］。在年輕小鼠，去除異常咬合後退變的髁突軟骨和軟骨下骨可以基本恢復［9］。

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咬合紊亂導致髁突退行性變的分子機制

咬合紊亂導致髁突局部受力異常，進而影響髁突軟骨細胞的增殖、分化和凋亡，並誘導髁突軟骨炎性反應及軟骨下骨吸收，最終致使髁突發生退行性變。

2. 1 軟骨細胞對生物力的信號轉換 對體外培養的髁突軟骨細胞進行力學載入，結果顯示其力學信號轉導主要是通過「整合素-細胞骨架系統及跨膜信息轉導分子G蛋白」進行的。適當壓力（90 kPa，60 min）下，髁突軟骨細胞中α5整合素及β1整合素表達上調，進而導致細胞骨架和F-actin的表達增強、排列緻密［10-11］；同時，胞膜信號分子G蛋白上調，激活磷脂酶C並水解胞膜上的磷脂，釋放三磷酸肌醇（inositol triphosphate，IP3）和二脂醯甘油（diacylglycerol，DAG），IP3再激活胞內Ca2+的一過性升高［12-14］，而DAG可激活蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）引起軟骨細胞中PKC高表達及向胞膜和胞核轉位，促進其下游信號ERK和JNK磷酸化及由胞漿向胞核的轉位，引起包括細胞增殖、微絨毛伸長、鹼性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）表達升高、一氧化氮（nitrogen monoxide，NO）分泌增加、前列腺素（prostaglandin，PG）水平降低、白細胞介素（interleukin，IL）-4和IL-6分泌增強及aggrecan 基因上調等在內廣泛的生物學效應［15-19］。進一步研究顯示，長時程壓力（90 kPa ，360 min）作用下只有β1整合素、JNK及IL-4表達升高，而α5整合素、G蛋白、PKC、ERK、NO、PG和IL-6等分子的表達比90 kPa加壓60 min時降低［11，13，16-17，19］，提示這些分子雖然也參與了長時程壓力的力學信號轉導過程，但隨著承受壓力時間的延長會產生類似「適應」的反應，因而會逐漸恢復至正常水平。而諸如F-actin、IP3通道等信號分子的表達在90 kPa作用360 min時表現為對持續的壓力刺激「無應答」狀態［10-12，14］，提示長時間壓力刺激可能會導致細胞骨架系統彈性破壞。

除了引起上述膜蛋白信號響應外，力刺激還可以導致髁突軟骨細胞表面高表達跨膜通道蛋白Cx43。Cx43蛋白分子構成的半通道在力刺激下會開放，這樣細胞內外可以出現直接的無選擇性小分子物質交流，因為該半通道允許分子質量小於1.2 ku的分子自由通過。Cx43有很強的力學敏感性，液流剪切力作用可引起軟骨細胞胞漿內的Cx43向細胞膜轉位，膜上通道蛋白的數量增加，小分子和離子通過量增加［20］。

力刺激還可以導致細胞外的Ca2+大量進入細胞內，導致細胞內Ca2+濃度升高，活化內質網等細胞器上鈣離子敏感受體（Calcium-sensing receptor，CaSR）［21］，或與Ca2+/鈣調素依賴型蛋白結合，綁定後調節下游信號分子的磷酸化［22］，進而影響多種生物學功能。

2. 2 咬合紊亂導致髁突軟骨炎性反應 咬合紊亂可以誘導大鼠和小鼠的髁突軟骨發生骨關節炎樣變，其中促炎因子腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α、IL-1和IL-6等表達顯著升高［23-25］。

髁突軟骨細胞表面有TNF-α的特異性受體TNF-R，兩者結合後通過受體的胞內段將TNF-α信號轉導到胞內，激活有絲分裂原活化蛋白MAPK途徑和NF-κB途徑［26］，兩者入核後影響下游目標基因的轉錄，其中也包括TNF-R［27］，因此能夠加強髁突軟骨細胞對TNF-α的敏感性。

IL-1β由軟骨細胞分泌，可與細胞膜上的受體結合。IL-1受體有2種： IL-1RⅠ和IL-1RⅡ，胞內信號轉導只通過 IL-1RⅠ完成。IL-1β與IL-1RⅠ結合後，可以激活胞內MAPK和NF-κB途徑，影響下游目標基因的轉錄，包括基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）、 PG、 NO等［28］。PG可以通過Cx43膜通道擴散至周圍基質中，造成炎性反應的擴散［20］；NO可減弱軟骨細胞抵禦損傷的能力，誘導軟骨細胞凋亡［29］。

IL-6可由IL-1和TNF-α誘導產生，通過調節其他損傷性細胞因子的表達發揮作用，如 IL-6可誘導IL-1RⅠ的表達，增強IL-1β的作用［30］。此外，IL-6可以降低軟骨細胞Ⅱ型膠原的表達，還可以刺激軟骨細胞和滑膜細胞產生PG，增強軟骨炎性反應［31］。

炎性因子通常會相互協同發揮作用，導致炎性反應的持續和擴大。將IL-1注射到大鼠的關節內能刺激軟骨破壞，與TNF-α聯合注射則軟骨破壞程度遠遠超過單獨注射IL-1［32］。一般認為，TNF-α引起急性炎性的發生，而IL-1則在炎性維持及軟骨破壞中起重要作用［33］。

2. 3 咬合紊亂對髁突軟骨細胞凋亡和增殖的影響 咬合紊亂誘導的髁突軟骨OA中，軟骨細胞死亡是主要的形態特徵之一。TUNEL染色顯示，無論在咬合紊亂大鼠還是小鼠模型的髁突軟骨中，都有大量典型的凋亡細胞［7-8，34］。異常力刺激和炎性因子都可以在軟骨細胞凋亡過程中發揮重要作用。

異常力刺激可以通過細胞膜上的G蛋白和Cx43蛋白通道導致胞漿內Ca2+濃度快速上升，而細胞為維持胞漿中Ca2+濃度穩定將多餘Ca2+轉運至內質網或者線粒體中，當Ca2+轉運超過一定限度後會導致內質網和線粒體的鈣超載，表現為內質網腔和線粒體的擴張［5］。內質網鈣超載會導致內質網caspase12增加，並使胞漿中caspase7轉移到內質網表面激活caspase12，進而通過caspase3引起細胞凋亡［35］。而線粒體膨脹後外膜通透性增高，其內的細胞色素c被釋放到細胞質中並與凋亡相關因子1結合，形成多聚體，使caspase9與其結合形成凋亡酶體複合物，caspase9被激活且能激活下游的caspase3 等，誘導細胞凋亡［36］。以上2種方式是髁突軟骨細胞凋亡的2條內源性通路。

TNF-α除可以誘導軟骨細胞炎性反應外，還可介導軟骨細胞凋亡。TNF-α與受體結合後通過死亡受體途徑活化caspase8，啟動級聯反應，激活下游的caspase3，誘導外源性細胞凋亡［37］。此外，TNF-α還可通過JNK信號通路誘導MAP4K3活化，進而使唯BH3域蛋白BID磷酸化，磷酸化的BID可直接激活BAX，從而激活細胞凋亡［38］。同時，MAP4K3亦可通過激活mTOR活化唯BH3域BAD及PUMA，進而抑制BCL-2等的抗凋亡活性，使BAX等發揮促凋亡效應［39］。

髁突軟骨細胞的增殖同樣受到多種信號分子的影響，正常軟骨細胞中甲狀旁腺激素相關蛋白（parathyroid hormone-related protein，PTHrP）與軟骨細胞膜上的惟一受體PTH1R結合，首先激活G蛋白後促進cAMP含量增加，進而激活蛋白激酶A（protein kinase A，PKA），產生系列下游效應，包括SOX9 磷酸化、 p57 表達抑制和誘導Gli3、Bcl2及cyclin D1表達升高，其中cyclin D1可以促進軟骨細胞增殖［40］。在咬合紊亂的大鼠或小鼠髁突軟骨中，PTHrP的表達雖然上調，但其惟一受體PTH1R卻表達急劇減少，使得PTHrP無法發揮促增殖作用［41］。此外，成纖維細胞生長因子2（fibroblast growth factor 2，FGF2）也參與軟骨細胞的分裂和增殖。在咬合紊亂刺激後，軟骨細胞合成FGF2增加，但受體FGFR1同樣表達減少，其促進增殖的作用無從發揮［42-43］。

2. 4 咬合紊亂對髁突軟骨細胞分化的影響 咬合紊亂誘導髁突軟骨細胞過度異常分化。當髁突軟骨細胞受到異常剪切力後，大量Ca2+內流至細胞內，活化內質網上的CaSR，進而導致胞漿中ERK磷酸化，核因子Runx2增多，一方面可以直接促進分化標誌分子ALP、骨鈣素（osteocalcin，OCN）的mRNA表達上調，降低軟骨細胞標誌物Aggrecan和Ⅱ型膠原的分泌，另一方面通過抑制PTH1R的表達抑制軟骨細胞增殖，兩相結合加速軟骨細胞終末分化［21］。此外，胞內Ca2+濃度上升後與鈣調素依賴性蛋白綁定結合形成複合體，進而活化胞漿中的鈣調素依賴性蛋白激酶（calmodulin - dependent protein kinase，CaMK） Ⅱ，促進印第安刺蝟因子（Indian hedgehog，Ihh）以及X型膠原等與分化有關分子的高表達［22，44］，導致增殖帶軟骨細胞的過早成熟分化。

Sox9是維持軟骨細胞特徵的重要核因子，cAMP依賴PKA使 Sox9 磷酸化後，Sox9與Ⅱ型膠原啟動子的結合能力便增加，且Ⅱ型膠原在軟骨細胞中的表達與Sox9 濃度呈正比關係［45］。在咬合紊亂的大鼠和小鼠髁突退變軟骨中，Sox9的含量顯著降低［46］，同時也伴有Ⅱ型膠原和Aggrecan顯著減少［5］，由此證實了Sox9在維持髁突軟骨特徵，抵禦異常分化中的作用。

胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）-1和轉化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β也是維持軟骨細胞表型的重要分子。IGF-1與其受體IGFR結合後，刺激軟骨細胞外基質Ⅱ型膠原和Aggrecan的合成與分泌。對培養的骨關節炎軟骨細胞給予 IGF-1刺激，可以顯著誘導Ⅱ型膠原和Aggrecan的表達與合成［47］。在咬合紊亂的髁突退變軟骨中，IGF-1的表達雖然上調，但其競爭性分子IGFBP3的含量增多更明顯，導致IGF-1不能充分與受體結合，從而無法發揮作用［48］。活化的TGF-β與其膜上的Ⅱ型受體結合後形成的複合物可以募集Ⅰ型受體，Ⅰ型受體通過絲氨酸/蘇氨酸的磷酸化而激活，將TGF-β信號傳遞至細胞內，刺激軟骨細胞增加Aggrecan和Ⅱ型膠原的表達［49］。正常軟骨中TGF-β表達水平較高，但OA軟骨中幾乎不表達［50］。咬合紊亂大鼠的髁突軟骨中，在早期會有TGF-β表達升高，但隨著刺激時間延長，其表達水平越來越低［48］，與之相對應的則是軟骨中Ⅱ型膠原和Aggrecan的減少以及終末分化分子的表達上調。敲除TGF-β基因的小鼠，其關節軟骨極易受到破壞［51］。這些研究都表明，TGF-β在維持軟骨表型方面起重要作用。

2. 5 咬合紊亂對軟骨基質降解和鈣化的影響 髁突軟骨的細胞外基質主要包括膠原纖維和蛋白多糖。膠原纖維形成骨架結構並提供了軟骨的抗張性能；蛋白多糖則與膠原結合，維持大分子基質結構的穩定性，為軟骨細胞提供了穩定的生存環境。咬合紊亂刺激下，髁突軟骨基質會發生降解，一方面軟骨細胞對這2種分子的合成和分泌減少，另一方面則是基質中2種分子的降解增多，結果導致Ⅱ型膠原和Aggrecan含量減少［5］。軟骨基質降解主要依靠聚蛋白多糖酶ADAMTS和MMPs。而ADAMTS主要為ADAMTS 4/5，兩者均可降解Aggrecan；MMPs主要為MMP 3/13，其中MMP 3主要降解Aggrecan，MMP 13則主要降解Ⅱ型膠原。此外，基質金屬蛋白酶組織抑制劑（TIMPs）可以抑制多數 ADAMTS 和部分MMPs的活性，在軟骨中含量最多的是TIMP-1。

咬合紊亂的髁突退變軟骨中降解酶增加，而TIMP-1減少［52］。TNF-α和IL-1與軟骨細胞膜上各自受體結合後可以激活MAPK途徑和NF-κB途徑，兩者入核後促進MMP 3/9/13和ADAMTS 4/5的基因轉錄［53］。TGF-β則可誘導TIMP-1的表達，發揮對抗MMPs和ADAMTS的作用［54］。在咬合紊亂誘導的退變髁突軟骨中，TNF-α和IL-1的含量增高而TGF-β表達減少［23，48］，導致了基質降解酶增多同時抑制物減少，從而加速軟骨基質降解。此外，MMP 13還可以受到其他分子的調節，例如內質網上CaSR活化後可以通過ERK途徑增多Runx 2表達，進而增強MMP 13的轉錄［21］；而CaMKⅡ可以使Hes1基因從轉錄抑制狀態轉變為轉錄活化狀態，Hes1則對MMP-13和ADAMTS5都有正性調節作用，CaMKⅡ與Hes1形成的複合體共同促進了下游分子MMP13和ADAMTS5的表達［44］。

在退變的髁突軟骨基質中還出現異常鈣化，異常力刺激直接作用於髁突軟骨使得肥大層軟骨基質內的膠原纖維斷裂，Ca2+結合位點暴露；同時異常力刺激促使軟骨細胞大量形成並外排基質小泡，加劇軟骨細胞的凋亡和壞死。基質小泡、 凋亡小體和細胞碎片提供了鈣鹽結晶所需的晶核；力刺激導致軟骨細胞 MGP、 CD73、 NPP1 和 ANK 等抑制基礎磷酸鹽晶體形成的分子表達減少，同時MMP13和ALP 等促進基礎磷酸鹽晶體形成的分子表達增加。以上的細胞及基質改變共同促進了基礎磷酸鹽晶體的形成，造成髁突軟骨基質內的異常鈣鹽沉積［5］。而沉積的基礎磷酸鹽晶體則可能通過Toll樣受體信號通路反過來促進MMP 3/13和ADAMTS 4/5的表達［5］，加速軟骨基質降解。

2. 6 咬合紊亂對髁突軟骨下骨的影響 咬合紊亂可以導致髁突軟骨下骨吸收，其原因是成骨-破骨平衡被打破。咬合紊亂能夠激活軟骨下骨骨髓間充質幹細胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）中 Wnt5a/Ror2 信號，一方面激活 BMSCs 中的 Ca2+/NFAT 通路，上調Cxcl12 的表達，促進破骨前體細胞趨化到BMSCs的周圍；另一方面上調 BMSCs 中Rankl表達，激活破骨前體細胞中的Ca2+/NFAT 通路，促進破骨細胞的形成，從而增強了的破骨活動［55］。此外，Sema 4D是由破骨細胞表達的蛋白，可與成骨細胞上的Plexin-B1 結合發揮抑製成骨細胞功能的作用。咬合紊亂動物髁突軟骨下骨中Sema 4D 和 Plexin-B1 的含量均顯著上升［56］，從而使得成骨細胞功能受到抑制，導致髁突軟骨下骨中新骨形成減少。

軟骨下骨的結構對於其上軟骨組織的健康有重要影響。採用腹腔注射經典 NF-κB信號抑制劑NBD肽的方法以及對實驗動物灌胃以口服鍶鹽的方法，分別抑制軟骨下骨的破骨細胞活性，結果發現二者均可緩解UAC所誘導的TMJ退行性變。而鍶鹽直接關節腔注射則對關節退行性變沒有明顯影響［57］。說明通過系統性干預 TMJ 髁突軟骨下骨異常的破骨活動，可以部分減輕咬合紊亂所誘導的TMJ 退行性變。

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結語

實驗性咬合紊亂可以導致TMJ髁突的退行性變。TMJ髁突病變程度與咬合紊亂的程度和作用時間相關，呈現一定的劑量效應。髁突軟骨和軟骨下骨是一個功能整體，相互影響。多種信號分子參與這一過程。這為臨床進行針對性的咬合治療以及病變關節的分子靶向提供了實驗基礎。

參考文獻 略

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