獎賞、運動、情緒與這個多巴胺轉運體有關

張俊海，解放軍306醫院，神經外科

多巴胺(Dopamine，DA)是一種重要的單胺類神經遞質，它參與獎賞、運動、情緒等多種大腦重要生理功能的調控。大腦內的多巴胺能神經元突觸末梢在接受到信號刺激後，會釋放多巴胺，導致細胞外多巴胺水平的升高，進而激活突觸後或突觸前的多巴胺受體，引起下游細胞或自身的反應。釋放出的多巴胺中的絕大多數會在幾個毫秒內迅速被清除，產生這一效應的一個主要方式就是多巴胺轉運體(Dopamine transporter，DAT)介導的多巴胺重攝取。多巴胺轉運體將重攝取的多巴胺轉運回胞內，一方面控制多巴胺的細胞外濃度，起到調節神經遞質信號強度的作用，另一方面，將細胞外多餘的多巴胺轉運回胞內存儲，起到維持多巴胺平衡的作用。多巴胺轉運體的功能異常會引起多巴胺系統的平衡紊亂，進而引起相關的神經系統的疾病，例如，抑鬱、注意力缺陷多動症(Attention-deficit/hyperactivity disorder, ADHD)，臨床上應用以多巴胺轉運體為靶點的藥物治療這些疾病。此外，多巴胺轉運體還是毒品可卡因、苯丙胺的作用靶點，這些毒品通過干擾多巴胺轉運體的正常功能，影響多巴胺系統的平衡導致成癮。因此，全面準確地理解多巴胺轉運體調控的分子機制，有助於加深對於相關神經系統疾病的認識，並有可能發展出更為有效的治療手段。

多巴胺轉運體是一種特異性分布於多巴胺神經元表面的跨膜蛋白，屬於Na+/Cl-離子依賴型轉運蛋白基因家族(SLC6A， solute carrier)。此家族還包括去甲腎上腺素、5-羥色胺、γ -氨基丁酸(GABA)、甘氨酸等神經遞質的轉運體，故而這個家族也被稱為神經遞質- 鈉離子共轉運家族(neurotransmitter transporters，NTT)。實際上目前在人類基因中已發現的該家族21個成員中，也有轉運牛磺酸、非遞質類氨基酸以及未知物質等非神經遞質分子的。這個家族的成員在核苷酸序列、氨基酸序列和蛋白結構上有較高的同源性，甚至出現一個底物可被不同轉運體轉運的現象，表明它們在功能上存在一定程度的重疊，例如在前額葉皮層，多巴胺的重攝取功能dopamine reuptake主要由去甲腎上腺素轉運體執行。

1991年Amara實驗室和Uhl實驗室首先克隆了大鼠的多巴胺轉運體核苷酸序列並分別在非洲綠猴細胞系COS細胞[9]和癌細胞系HeLa細胞中表達成功[10]，之後其它種屬的多巴胺轉運體序列也相繼被克隆。其中，人源多巴胺轉運體基因位於第5條染色體上，長約64 kb，包括15個外顯子。目前發現在3』非翻譯區和第八內含子具有可變串聯重複序列(variable number tandem repeat，VNTR)。結合臨床的影像學研究結果，VNTR與ADHD具有相關性。然而，不同拷貝的VNTR只會影響多巴胺轉運體的表達量[14,15]，與多巴胺重攝取功能的差異並無關聯，故尚無法解釋內在機制。此外，抑鬱與多巴胺轉運體基因多態性的關聯性也得到臨床影像學的支持。人源的多巴胺轉運體含有620個氨基酸，大、小鼠的則各含有619個，它們在序列同源性上超過90%。作為一個跨膜蛋白，多巴胺轉運體在脂雙層以外的環境中不穩定，難以純化和結晶。目前雖然已有果蠅的多巴胺轉運體晶體結構的研究，但哺乳動物多巴胺轉運體的蛋白三維結構迄今尚未被解出。根據多巴胺轉運體氨基酸殘基的疏水性以及細菌同源蛋白亮氨酸轉運體(LeuTAa)的結構，推測多巴胺轉運體可能具有12個跨膜結構區，N端和C端伸向胞內，第2個胞外環相對較大。嗜熱菌蛋白亮氨酸轉運體(LeuTAa)與哺乳動物多巴胺轉運體相比，約有20%的序列相似性。曾解析出LeuTAa晶體結構的Eric Gouaux實驗室於最近通過對果蠅多巴胺轉運體突變體與三環類抗抑鬱葯去甲替林(nortriptyline)結合形成的晶體進行X射線衍射分析，第一次解析了多巴胺轉運體的三維結構。

值得注意的是，果蠅多巴胺轉運體與哺乳動物多巴胺轉運體的序列相似性超過50%，特別是在跨膜區段序列更為保守，因此他們的這一工作對於理解哺乳動物多巴胺轉運體的結構具有更高的參考價值。與LeuTAa相同，多巴胺轉運體確實具有12個跨膜螺旋結構區，其中第1-5和6-10跨膜區形成一個偽對稱結構，中間組成了底物通過的通道。去甲替林將果蠅的多巴胺轉運體突變體限制在一個向細胞外開口的構象，並結合在多巴胺轉運體第1、3、6、8跨膜區圍繞的空間中，一個氯離子和兩個鈉離子在去甲替林附近結合於多巴胺轉運體上。在多巴胺轉運體胞外開口的構象下，LeuTAa所不具有的C端胞內段在空間上位於多巴胺轉運體胞內開口處，和第一胞內環有相互作用，像一個門閂封閉了多巴胺轉運體的胞內通道開口，提示C端的空間位置以及修飾位點很可能直接與多巴胺轉運體重攝取功能活性有關，為理解之前已發現的C端修飾位點在多巴胺重攝取中的作用，從結構生物學的角度提供了支持。在多巴胺轉運體側翼，由第1a、5、7跨膜區組成空隙中，結合有一分子的膽固醇，提示多巴胺轉運體有可能與膜上的膽固醇直接結合，這對多巴胺轉運體定位在脂筏上是進一步的支持[20]。雖然果蠅多巴胺轉運體結構的解析為理解多巴胺轉運體的功能提供了更多線索，但略有遺憾的是，為了穩定多巴胺轉運體的結構，實驗者將第3和第4跨膜區之間的第2胞外環的43個氨基酸殘基以及N端胞內段的20個氨基酸殘基予以刪除[18]，而這兩個區域在調節多巴胺轉運體功能方面有重要作用。多巴胺轉運體與其它蛋白質相互結合的位點大多數位於多巴胺轉運體伸向胞內的N端和C端胞內段，多巴胺轉運體重要的翻譯後修飾位點也多位於此。N端胞內段接近第1跨膜螺旋區的第60位精氨酸(Arg60)是個非常保守的位點，體外實驗提供的證據顯示，這個位點和第335位酪氨酸(Tyr335)的陽離子-π相互作用對於第1a跨膜螺旋區(TM1a)的空間構象變化至關重要，會引起多巴胺轉運體細胞內外開口構象變化的轉換。與Arg60相鄰的蘇氨酸(Thr62)的磷酸化，很可能會導致Arg60的空間位移，進而影響重攝取和多巴胺的流出。靠近膜的Thr53位點磷酸化也會引起多巴胺轉運體的功能改變，Thr53和附近的殘基是潛在的SH3結合位點，很可能也是通過TM1a發揮其作用的。N端遠端的第7位絲氨酸(Ser7)殘基，可被蛋白激酶C(PKC)磷酸化，此位點的突變會影響多巴胺轉運體與可卡因類似物的結合。N端除了磷酸化位點，還有4個泛素化位點——第19、27、35、63位賴氨酸(Lys)，它們都是在PKC激活的條件下被修飾，影響多巴胺轉運體在胞內的降解和重新上膜利用的過程。多巴胺轉運體的C端胞內段翻譯後修飾位點不及N端多，但是很多與多巴胺轉運體有相互作用的蛋白多結合在C端， 如Rin[28]、Parkin、CaMKII[31]、α-synuclein等。C端靠近第12跨膜螺旋區的第580位半胱氨酸殘基，是一個棕櫚醯化修飾位點，被認為可以影響多巴胺轉運體的功能。此外C端的若干位點與多巴胺轉運體在胞內各個膜結構中的定位相關。多巴胺轉運體的糖基化位點位於胞外的第2個環上的3個天冬醯胺(Asn181、188、205)殘基上，糖基化位點的突變，會降低多巴胺轉運體的表達以及在膜上的分布，但是對多巴胺轉運體分子本身重攝取功能似乎沒有影響。

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