替莫唑胺治療膠質瘤的耐藥性產生機制

膠質瘤是一種原發性腦腫瘤，其惡性程度高，約佔所有原發性神經系統腫瘤的３０％． 致死率在３５ 歲以下的全部惡性腫瘤中居第二位． 其中，多形性膠質母細胞瘤（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍ， ＧＢＭ）又占腦膠質瘤的一半以上，其惡性程度最高，每年的發病率約為百萬分之五． 因為ＧＢＭ 生長快速，侵襲性強，僅靠手術很難完全切除，這使得腦膠質瘤極易在術後複發 ． 據有效數據統計，原發性的ＧＢＭ 多發於年齡大於５５ 歲的患者，而繼發性的ＧＢＭ 多發於年齡在５５ 歲以下的患者，大多是由低級別的膠質瘤發展而來，只佔ＧＢＭ 的１０％左右 ． 目前，對膠質瘤的治療主要是手術切除聯合放化療，臨床實踐證明化療可以有效提高惡性膠質瘤患者的生存時間與生存率．替莫唑胺（ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ， ＴＭＺ）是一種口服烷化劑，能穿過血腦屏障直達病灶，是臨床上化療腦膠質瘤的一線常用藥物之一 ． ＴＭＺ 通過攻擊腫瘤細胞的ＤＮＡ，致使ＤＮＡ 烷基化受損，損傷的部位主要在Ｎ７，Ｎ３，Ｏ６ 位的鳥嘌呤以及Ｏ３ 位腺嘌呤上，ＤＮＡ 烷基化受損以後會產生交聯，從而誘導癌細胞死亡 ．有研究表明，用ＴＭＺ 治療人腦膠質瘤的有效率約為４５％． 其中，腦膠質瘤對ＴＭＺ 產生耐藥性是導致化療失敗的最主要原因．有文獻研究 發現，腦膠質瘤產生ＴＭＺ 耐藥性不是由單一因素影響導致的，主要還包括ＤＮＡ 損傷修復，腫瘤細胞中促癌與抑癌基因的表達，化療藥物刺激後機體的應急反應以及藥物對組織的滲透性等方面．

ＴＭＺ 的作用機制及結構

ＴＭＺ 是一種僅在酸性ｐＨ 下穩定存在的咪唑並四嗪類烷化劑． 該葯進入體循環以後快速轉化為活性化合物３?甲基?（三嗪?１?）咪唑?４?甲醯胺（ＭＴＩＣ），ＭＴＩＣ 隨後與水反應生成５?氨基咪唑?４?甲醯胺（ＡＩＣ）和高反應性甲基重氮陽離子（半衰期＝ ０．４ ｓ）． 該不穩定的陽離子可以通過甲基轉移引發ＴＭＺ 的細胞毒性反應 ． 該細胞毒性反應主要發生在ＤＮＡ 分子Ｎ７，Ｎ３，Ｏ６ 位的鳥嘌呤以及Ｏ３ 位腺嘌呤上，雖然Ｏ６位上的烷基化只佔所有甲基化總數的５％左右，但是它是引起ＴＭＺ 產生細胞毒性的最主要原因． 比較而言，Ｎ７，Ｎ３ 位上的烷基化相對頻繁，約佔烷基化總數的８０％～８５％和８％～１８％ ．

腦膠質瘤對ＴＭＺ 產生耐藥性的機制

隨著時間的推移，腦膠質瘤細胞對ＴＭＺ 引起的損傷產生抵抗． 這個抗性的產生與多個機制有關，如ＤＮＡ 修復機制，表皮生長因子受體（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ ｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ， ＥＧＦＲ）的過表達，ｇａｌｅｃｔｉｎ?１ 和雙微體２（ｍｕｒｉｎｅ ｄｏｕｂｌｅ ｍｉｎｕｔｅ ２， Ｍｄｍ２）的表達，ｐ５３ 突變以及磷酸酶和張力蛋白同源物（ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ａｎｄｔｅｎｓｉｎ ｈｏｍｏｌｏｇ， ＰＴＥＮ）的表達． 此外，ＴＭＺ 對腦膠質瘤耐藥性的產生與ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）表達譜的改變也有一定的相關性．ＭＧＭＴ　ＧＢＭ 抗性的主要機理涉及甲基鳥嘌呤甲基轉移酶（ＭＧＭＴ），一種修復ＤＮＡ 的酶． ＭＧＭＴ相對分子質量為２２ ｋＤａ，它不僅可以除去連接到Ｏ６位鳥嘌呤中的甲基，而且可以除去其它烷基如乙基、異丙基和丁基 ． 比較而言，ＭＧＭＴ 除去甲基比其他烷基的速度要快得多 ． 通過除去Ｏ６ 位鳥嘌呤上的甲基，可以直接修復由ＴＭＺ 引起的病變 ． ＭＧＭＴ作為一種自殺式的修復酶，當其修復ＤＮＡ 上的甲基時，其１４５ 位催化中心上的半胱氨酸殘基發生改變，從而導致其失活 ． 隨後ＭＧＭＴ 被蛋白酶體降解，不再循環發揮作用 ． 在不同類型的腫瘤中ＭＧＭＴ的表達水平有所不同 ． ＭＧＭＴ 基因不常發生突變或缺失 ． ＭＧＭＴ 的表達水平與ＭＧＭＴ 啟動子的甲基化相關． 一些研究表明，ＭＧＭＴ 的表達水平與多鳥嘌呤胞嘧啶（ＣｐＧ）的甲基化概率成反比 ． ＭＧＭＴ基因的沉默是通過其ＣｐＧ 島啟動子上的高度甲基化來完成的 ． 有數據統計，約有４５％的新患ＧＢＭ 的患者呈現出ＭＧＭＴ 啟動子的甲基化，因此他們對ＴＭＺ 的治療反應更好 ． 能夠抑制ＭＧＭＴ 活性的治療分子如Ｏ６?苄基鳥嘌呤（Ｏ６?ＢＧ）和Ｏ６?（４?溴苯基）鳥嘌呤已被用於ＴＭＺ 治療前的預治療中 ． 在體內和體外實驗的研究中，這些化合物通過與ＭＧＭＴ作用降低細胞中ＭＧＭＴ 的含量，從而達到增強

ＴＭＺ治療活性的目的． 它們主要通過將苄基或溴苯基共價轉移到ＭＧＭＴ 的活性半胱氨酸殘基上，引起該酶的不可逆失活，從而發揮效應． 儘管這些偽底物使得ＴＭＺ 治療的有效性提高，但它們對正常細胞，特別是骨髓細胞的高毒性導致這些分子不能被廣泛應用在臨床治療中 ．　ＭＭＲ　ＤＮＡ 錯配修復（ＭＭＲ） 是一個修復ＤＮＡ 合成過程中產生核苷酸鹼基錯配的系統 ． 在沒有ＭＧＭＴ 存在的情況下，Ｏ６?ＭＧ 持續存在，並且與胸腺嘧啶配對． 所得到的Ｏ６?ＭＧ／ Ｔ 可以被ＭＭＲ 識別，隨後新合成的鏈被切除，但是Ｏ６?ＭＧ 鏈保持完好無損． 當產生另一條鏈時，重複該修復周期． 胸腺嘧啶插入和切除的無效循環導致細胞周期停滯和凋亡 ． 由ＭＭＲ 蛋白複合物突變引起ＭＭＲ 途徑受損，從而導致ＭＭＲ 對ＴＭＺ 誘導的Ｏ６?ＭＧ 加合物識別和修復失敗． 這些突變導致ＤＮＡ 錯配繼續複製並允許細胞周期進行，使得ＴＭＺ 治療效果降低 ． 而且，這些突變可能在細胞周期中存在或在ＴＭＺ 治療過程中獲得 ． 鑒於其重要性，我們應制定恢復ＭＭＲ 系統的策略，以期提高ＴＭＺ 的療效．ＢＥＲ　該系統含有多種蛋白質和酶，能夠修復多種因素導致的ＤＮＡ 損傷，如氧化劑，電離輻射或烷化劑 ． 其中，ＢＥＲ 系統中對ＤＮＡ 損傷起主要修復作用的一種酶是多聚（ ＡＤＰ?核糖） 聚合酶?１（ＰＡＲＰ?１）． 該酶與ＤＮＡ 結合後以ＮＡＤ＋作為底物，開始合成ＡＤＰ?核糖聚合鏈（ＰＡＲ），其能夠招募ＢＥＲ複合蛋白（ＸＲＣＣ１，ＤＮＡ 聚合酶，連接酶，皮瓣核酸內切酶１）進行ＤＮＡ 修復 ．ＢＥＲ 途徑可以修復由ＴＭＺ 造成的Ｎ３ 和Ｎ７ 位甲基化 ． 如果不修復的話，Ｎ３ 位病變能夠引起致命性的損傷 ． 這些由ＴＭＺ 引起的超過９０％以上的甲基化都可以迅速被ＢＥＲ 途徑修復． 因此，當ＢＥＲ 途徑的成員發生突變時ＴＭＺ 引起的細胞毒性會增強． 因此，利用ＰＡＲＰ 抑製劑限制ＢＥＲ 的活性有望成為增強ＴＭＺ 臨床治療效果的策略 ． 與Ｏ６ 位上的甲基化相比，Ｎ７ 和Ｎ３ 位上的甲基化水平更高，儘管如此，在ＴＭＺ 耐葯中ＢＥＲ 發揮的作用不如ＭＭＲ或ＭＧＭＴ 重要．

ＥＧＦＲ 和半乳凝素?１ 的過表達

ＥＧＦＲ　ＥＧＦＲ，相對分子質量為１７０ ｋＤａ，它作為一個受體分子，在腫瘤發展中通過刺激細胞增殖、遷移、血管生成促使細胞對化療產生抵抗 ． 配體與野生型ＥＧＦＲ 結合將導致以下信號通路被激活：Ｒａｓ／ Ｒａｆ／ ＭＡＰＫ（有絲分裂原激活激酶） 或ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ ｍＴＯＲ ． 這些信號途徑在ＧＢＭ 中被強烈激活後會導致細胞的自噬抑制和凋亡減少，從而使ＴＭＺ的效力減弱 ．在原發性的ＧＢＭ 中，ＥＧＦＲ 基因擴增是最常見的遺傳改變，其發生率為４０％ ，而且在這些原發性的ＧＢＭ 中，大約有一半的腫瘤都攜帶重排ＥＧＦＲ 的基因，這導致在這些腫瘤中表達野生型ＥＧＦＲ 以及突變的ＥＧＦＲ ． 在腦膠質母細胞瘤中，ＥＧＦＲ 突變體Ⅲ（ＥＧＦＲｖⅢ）是ＥＧＦＲ 受體中最常見的突變體，其具有一定的結構特徵，胞外結構域中缺失了２６７ 個氨基酸，這導致受體與具有組成型酪氨酸激酶活性的配體不能結合．臨床上已經開發了一種治療分子來抑制ＥＧＦＲ信號通路． 例如，西妥昔單抗１，一種可以特異性結合ＥＧＦＲ 的單克隆抗體． 它可以抑制下游信號轉導途徑 ． 西妥昔單抗能夠識別野生型ＥＧＦＲ 和ＥＧＦＲ?ｖＩＩＩ 受體並與之結合，引起細胞增殖受到抑制． 但是，在臨床治療中使用西妥昔單抗治療ＧＢＭ 的結果令人失望，患者的中位生存期只有五個月 ．

目前，以ＴＭＺ 和西妥昔單抗結合放療治療原發性ＧＢＭ 的Ⅰ／Ⅱ期臨床試驗正在進行 ． 此外，吉非替尼１ 和厄洛替尼１ 作為酪氨酸激酶抑製劑（ＴＫＩｓ）也被用於抑制ＥＧＦＲ 信號通路的激活． 它們通過與細胞質中ＡＴＰ結構域結合阻斷ＥＧＦＲ 磷酸化，從而抑制ＥＧＦＲ 介導的下游途徑活化． 這些分子在針對ＧＢＭ 患者治療的臨床試驗（Ⅰ期和Ⅱ期）中已經進行了測試 ．雖然使用吉非替尼或厄洛替尼１ 聯合放射治療可以適度延長患者生存時間， 但是結果並不令人滿意 ． 有研究對ＴＫＩｓ 和ＴＭＺ 的關聯性進行了評估，結果顯示與放射治療聯合運用後接受ＴＭＺ 治療的患者中位生存期確實得到了改善，但只有一小部分患者的疾病發展可被控制． 實際上，ＧＢＭ 患者的治療結果與ＰＴＥＮ 的存在相關 ． 而且，有文獻報道，ＭＧＭＴ 啟動子甲基化水平高和具備完整ＰＴＥＮ 的患者具有更顯著的生存優勢 ．半乳糖凝集素?１　該蛋白屬於凝集素家族的一員，它含有一個對β?半乳糖苷高親和力的碳水化合物識別結構域（ ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ，ＣＲＤ） ． 半乳糖凝集素?１ 嵌入細胞膜，在細胞內外都有部分結構暴露，其位於細胞內和細胞外的結構功能不同，主要依賴於蛋白質?蛋白質相互作用． 其細胞外活性取決於其本身的凝集素活性 ． 星形細胞瘤的惡性程度與半乳糖凝集素?１ 的表達水平之間呈現出一定的相關性 ．半乳糖凝集素?１ 是一種缺氧調節蛋白，是由缺氧刺激產生和分泌的 ． 半乳糖凝集素已被證明在癌症生物學的多個方面發揮重要作用：通過和整合素以及細胞外基質部分相互作用來影響細胞的遷移 ；通過調節ＯＲＰ１５０，一種控制血管內皮生長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ， ＶＥＧＦ） 的成熟和分泌的因子 ， 來刺激血管以及轉移灶的形成 ；通過與Ｒａｓ 蛋白相互作用 以及調控ｐ５３在核內的遷移 影響化療和放療的抗性． 此外，半乳糖凝集素?１ 通過促進凋亡來發揮抑制Ｔ 細胞效應子功能，允許腫瘤細胞逃避免疫系統 ． 鑒於其在化療和放療抗性中的重要作用，考慮了通過不同策略靶向半乳糖凝集素?１ 來提高膠質瘤患者的治療效果．例如，合成乳果糖作為一種β?半乳糖苷對半乳糖凝集素?１ 的ＣＲＤ 域具有較高的親和性 ． 半乳甘露聚糖１ 能夠在不同於ＣＲＤ 的位點與半乳糖凝集素?１ 結合，從而發揮抑制作用 ． 且半乳甘露聚糖１ 經ＦＤＡ批准用於治療結腸直腸癌，並獲得了很好的結果． 但是，必須進行更多的調查以評估其對ＧＢＭ 的影響．ｐ５３ 和Ｍｄｍ２　在人體內部，ｐ５３ 是由ＴＰ５３ 編碼的腫瘤抑制蛋白，當細胞處於應急狀態，比如ＤＮＡ受到損傷時，可導致細胞生長暫時或永久停止 ．某些頻繁的ＴＰ５３ 突變導致其腫瘤抑制功能喪失，且ｐ５３ 突變蛋白大量累積． 野生型ｐ５３ 由於Ｍｄｍ２ 的抑制作用其在正常條件下具有較短的半衰期，但在癌細胞中，這個ｐ５３ 突變體的半衰期不經歷這種抑制並累積到很高的水平 ． 除了ＴＰ５３ 基因的突變促進腫瘤細胞生長和放化療抗性之外 ，Ｍｄｍ２ 作為一個在ＧＢＭ 中經常擴增的基因， 其過表達也會導致ｐ５３ 的功能喪失 ．由於ｐ５３ 缺失在膠質瘤發生髮展以及抗癌藥物的抗性中發揮關鍵作用，目前正在研究多種策略以恢復ｐ５３ 的作用． 其中用以恢復ｐ５３ 功能和抑制ｐ５３?Ｍｄｍ２ 相互作用的基因治療是最重要的 ． 因為基因治療可以直接將野生型ｐ５３ 傳遞到癌細胞中． 有文獻報道，用ｐ５３ 的腺病毒感染細胞可以改善複發性惡性膠質瘤患者的預後 ． 由於Ｍｄｍ２ 在膠質瘤中過度表達，靶向Ｍｄｍ２ 與ｐ５３ 的相互作用也是一種潛在的癌症治療策略 ． 用ｐ５３?Ｍｄｍ２ 結合抑製劑處理細胞也會導致野生型ｐ５３ 蛋白穩定和積累 ，之中有代表性的分子之一Ｎｕｔｌｉｎ?３ 已經進入人們的視野，並且在臨床前研究中得到了關注． Ｎｕｔｌｉｎ?３ 能夠在ｐ５３ 的結合域競爭性的結合Ｍｄｍ２ 有關，這一結果導致ｐ５３ 遊離出來從而被激活 ． ｐ５３?Ｍｄｍ２ 結合抑製劑的主要限制作用僅在表達野生型ｐ５３ 的癌細胞中有效，在表達突變型ｐ５３ 的細胞中沒有此種作用． 此外，重要的是應該考慮該抑製劑可能導致的毒性作用，以及在表達ｐ５３ 野生型的細胞中引起ｐ５３ 的過表達．ＰＴＥＮ　ＰＴＥＮ 是一種腫瘤生長抑制酶，由於它在ＧＢＭ 中經常突變導致腫瘤細胞增殖能力加強 ． ＰＴＥＮ 通過抑制ＰＩ３Ｋ 和Ｍｄｍ２ 的轉錄保護野生型ｐ５３ 免於滅活和降解 ． 而且，ｐ５３ 能夠通過與ＰＴＥＮ 啟動子結合來增強ＰＴＥＮ 基因轉錄而增加ＰＴＥＮ 活性 ． 此外，ＰＴＥＮ 具有增強ＴＰ５３ 基因轉錄活性的功能，它可以通過與ｐ５３ 結合來提高ｐ５３ 的穩定性 ． 在ＰＴＥＮ 缺失或突變的腫瘤中，恢復野生型ＰＴＥＮ 的表達可以抑制腫瘤細胞的致瘤性，促進凋亡，並增加癌細胞的化療敏感性 ． 這表明野生型ＰＴＥＮ 和野生型ｐ５３ 的關聯可以增強腫瘤細胞對抗癌藥物的敏感性，特別是對ＴＭＺ．ｍｉＲＮＡｓ　在癌症的發展進程中，ｍｉＲＮＡ 作為一類新型致癌基因或抑癌基因，發揮著重要的作用 ． 一些研究表明，異常的ｍｉＲＮＡ 表達可能影響ＴＭＺ 對ＧＢＭ 的敏感性 ，例如，在ＴＭＺ 耐葯細胞株中ｍｉＲ?２１，ｍｉＲ?１９５，ｍｉＲ?４５５?３ｐ 和ｍｉＲ?１０ａ?被上調 ． 相反的，有些ｍｉＲＮＡ 在腫瘤細胞中被下調，如實驗驗證ｍｉＲ?１４５ 在ＧＢＭ 腫瘤細胞中下調，這增強了ＴＭＺ 的抗性 ． 鑒於ｍｉＲＮＡ 在癌症發展中的雙面性，我們可以利用ｍｉＲＮＡ 來開發新的治療策略，使用反義寡核苷酸或ｍｉＲＮＡ 敲除手段使促癌ｍｉＲ?ＮＡ 可以下調 ，而用ｍｉＲＮＡ 模擬物代替抑癌ｍｉＲＮＡ 使其表達上調 ，以其達到改善癌症患者生存的目的．

腦膠質瘤對ＴＭＺ 的耐藥性不是受單一因素的影響． 通過針對相關分子的進一步研究，可以推進臨床個體化治療的方案實行． 相較於傳統療法而言，個體化的化療方案可以降低膠質瘤對藥物的耐藥性，增加療效，改善患者的預後，同時，探討膠質瘤對ＴＭＺ 耐藥性機制進展有助於找到某些導致腫瘤複發的新靶點，為膠質瘤的治療提供有效的新方案．

徐小珊，塗艷陽　,第四軍醫大學唐都醫院實驗外科

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